核酸電泳檢測方法有哪些

㈠ 核酸檢測方法有哪些

核酸檢測主要是鼻拭子或咽拭子法，經由鼻孔或口腔插入取得上呼吸道分泌物標本後送實驗室檢測。核酸檢測主要是指目前對於新型冠狀病毒肺炎的一種確診的實驗手段，核酸檢測一般分為鼻拭子、咽拭子或者肺泡灌洗液以及痰液，通過呼吸道的標本，我們在實驗室里可以檢測2019新型冠狀病毒的核酸，從而作為臨床診斷的重要的依據。那臨床上目前最常採用的檢測方法是鼻拭子或者是咽拭子，操作的時候由醫護人員採用特製的長柄取樣的棉簽，經由鼻孔或者經由口腔插入到鼻腔及咽腔中，在咽喉壁或者鼻腔的粘膜上進行塗抹，取得上呼吸道分泌物標本，這個標本取出之後再送到實驗室進行相關的核酸檢測。在做的過程中患者不用緊張，可能會有輕微的不適例如惡心，相信配合好醫護人員的話，能夠很快完成這個檢查，不會給您帶來很大的影響。

㈡ 核酸檢測方法

對於新型冠狀病毒的核酸檢測，首先根據試劑盒說明書」樣本要求「部分進行樣本採集，常規的樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。

獲得患者樣本後，需盡快進行檢測，如無法立即檢測需要轉運的樣本，應按照說明書的要求進行低溫封裝，並送到專門的檢測機構進行檢測。檢測機構收到樣本後，對樣本進行核酸提取，核酸提取試劑應使用批准產品說明書中指定的核酸提取試劑盒。

病毒RNA需要首先逆轉錄為cDNA，再進行擴增檢測。PCR擴增和檢測應使用批准產品說明書中指定的熒光定量PCR儀，通過熒光定量PCR所得到的樣本Ct值的大小，可以判斷患者樣本中是否含有新型冠狀病毒。

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核酸檢測原理

所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），新型冠狀病毒是一種僅含有RNA的病毒，病毒中特異性RNA序列是區分該病毒與其它病原體的標志物。新型冠狀病毒出現後，我國科學家在極短的時間里完成了對新型冠狀病毒全基因組序列的解析。

並通過與其它物種的基因組序列對比，發現了新型冠狀病毒中的特異核酸序列。臨床實驗檢測過程中，如果能在患者樣本中檢測到新型冠狀病毒的特異核酸序列，應提示該患者可能被新型冠狀病毒感染

㈢ 核酸凝膠電泳實驗需要注意什麼，請有經驗的前輩幫忙指

核酸凝膠電泳實驗需要凝膠電泳操作注意事項： 1. 緩沖系統：在沒有離子存在時，電導率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強度的緩沖液中，電導很高並產熱，可能導致DNA變性，因此應注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環是可取的。 2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。 3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡，影響電泳結果。瓊脂糖凝膠電泳注意事項及操作流程 凝膠電泳操作注意事項： 1. 緩沖系統：在沒有離子存在時，電導率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強度的緩沖液中，電導很高並產熱，可能導致DNA變性，因此應注意緩沖液的使用是否正確。長時間高壓電泳時，常更新緩沖液或在兩槽間進行緩沖液的循環是可取的。 2. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。 3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡，影響電泳結果。 4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據加樣孔的大小及DNA中片段的數量和大小而定，過多的量會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散，對於較大的DNA此現象更明顯。 5. 電泳系統的變化會影響DNA的遷移，加入DNA標准參照物進行判定是必要的。 6. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。 7. DNA遷移率取決於瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。採用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應採用聚丙烯醯胺凝膠電泳以提高解析度。

㈣ 瓊脂糖凝膠電泳具體操作步驟是什麼需要注意什麼事項

一、操作步驟：

1、電泳方法

一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要解析度高的電泳，特別是只有幾個bp的差別應該選擇聚丙烯醯胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應該使用脈沖凝膠電泳。

2、凝膠濃度

對於瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。

3、緩沖液

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。

4、電壓和溫度

電泳時電場強度不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低於30℃，對於巨大的DNA電泳，溫度應該低於15℃。

5、DNA樣品的純度和狀態

注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產生條帶模糊和條帶缺失的現象。乙醇沉澱可以去除多餘的鹽，用酚可以去除蛋白。

6、DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。

7、Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較准確。

8、凝膠的染色和觀察

實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB），染色效果好，操作方便，但是穩定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時應根據染料不同使用合適的光源和激發波長，如果激發波長不對，條帶則不易觀察，出現條帶模糊的現象。

二、注意事項：

1、巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導致缺帶。

2、高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現象。

3、電泳緩沖液多次使用後，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。

4、如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現缺帶現象。

5、變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現不規則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。

6、太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。

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瓊脂糖凝膠具有網路結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決於凈電荷的性質和數量，而且還取決於分子大小，這就大大提高了分辨能力。

但由於其孔徑相比於蛋白質太大，對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道，現廣泛應用於核酸的研究中。

蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據這個原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。

瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段，其解析度雖比聚丙烯醯胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達10^7bp的DNA片段。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由於糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。

㈤ 實驗室中常用的DNA分子量的測定方法有哪些

第一種方法最常用
1）紫外吸收法也就是測量OD（260）和OD（280）的吸收值,這樣的方法其它的雜質對測量結果影響大一點,因為其它雜質在這兩個吸收波長也有吸收.
（2）熒光法,用PicoGreen熒光染料,測定DNA,RNA濃度比較靈敏,並且適合測量低濃度和微量DNA和RNA,並且受其它雜質的影響不大,缺點要有專門的熒光檢測儀器,試劑比較昂貴.
純化DNA可以買試劑盒,主要有膜吸附法,磁珠分離法,都很方便.
RNA與DNA最重要的區別一是RNA只有一條鏈,二是它的鹼基組成與DNA的不同,RNA沒有鹼基T（胸腺嘧啶）,而有鹼基U（尿嘧啶）.所以導致他們有以下性質上的不同.
1.兩性解離：DNA無,只有酸解離,鹼基被屏蔽（在分子內部形成了H鍵）.RNA有,有PI.
2.粘度大：DNA;RNA,粘度由分子長度/直徑決定,DNA為線狀分子,RNA為線團.
3.鹼的作用：DNA耐鹼RNA易被鹼水解.
4.顯色反應：
鑒別DNA和RNA+濃HCl RNA ------→ 綠色化合物
DNA ------→ 藍紫色化合物苔黑酚
二苯胺啡啶溴紅（熒光染料）和溴嘧啶都可對DNA染色,原理是卡在分子中,DNA的離心和電泳顯色可用它們.
DNA和RNA的鑒別染色
利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA.吖啶橙作為一種熒光染料已被用於染色固定,非固定細胞核酸,或作溶酶體的一種標記.觀察死亡細胞熒光變色性變化以及區別分裂細胞和靜止細胞群體.雖然測定DNA和RNA含量時較難獲得好的重復性結果,但該方法已被許多實驗室廣泛採用.
5.溶解性：都溶於水而不溶於乙醇,因此,常用乙醇來沉澱溶液中的DNA和RNA.DNA溶於苯酚而RNA不溶,故可用苯酚來沉澱RNA.
6.紫外吸收：核酸的λm＝260nm,鹼基展開程度越大,紫外吸收就越厲害.當A＝1時,DNA：50ug/ml,RNA和單鏈DNA：40ug/ml,寡核苷酸：20ug/ml.用A260/A280還可來表示核酸的純度.
7.沉降速度：對於拓撲異構體（核苷酸數目相同的核酸）,其沉降速度從達到小依次為：RNA ; 超螺旋DNA > 解鏈環狀DNA ; 鬆弛環狀DNA ; 線形DNA也就是在離心管中最上層是線形DNA,最下面是RNA.
8.電泳：核苷酸、核酸均可以進行電泳,泳動速度主要由分子大小來決定,因此,電泳是測定核酸分子量的好方法.
9.DNA分子量測定最直接的方法：用適當濃度的EB（溴嘧啶）染色DNA,可以將其他形式的DNA變成線形DNA,用電鏡測出其長度,按B-DNA模型算出bp數,根據核苷酸的平均分子量就可計算出DNA的分子量.

㈥ 核酸檢測方法有幾種

核酸定量常用方法如下：
①
光吸收法：核酸中鹼基共軛結構在近紫外光波長260nm處有最大吸收，吸收強度與核酸濃度成正比，因此可以用於核酸定量。
②
定P法：核酸中P含量約為9.5%,因此可以通過測定樣品中的有機P量來進行核酸定量。

㈦ 核酸檢驗方法

核酸檢測具體流程如下：
1. 核酸提取
使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設備並按說明書操作。提取RNA時應注意防止RNA降解。DNA應置於-20℃保存，RNA和需長期保存的DNA應置於-80℃保存。
2. 逆轉錄合成cDNA
逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進行第一輪擴增反應。逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。使用商品化RT-PCR一步法試劑進行第一輪擴增反應。
3. PCR擴增反應（使用二次擴增的套式PCR擴增方法）
PCR反應需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴增儀中，按照設定的程序進行擴增。使用二次擴增的套式PCR擴增方法。
4. 擴增產物定性分析
擴增產物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標准比較，判斷擴增片段是否在預期的分子量范圍內。其它擴增產物分析方法還有限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。自動化核酸擴增儀使用酶聯比色分析或熒光探針雜交等原理測定。
5.結果判定和完成報告單
（1）實驗成立的條件：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、雙份平行樣品結果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應結果的判定。
（2）HIV核酸檢測陽性：發現核酸陽性反應，應該重復採集樣品進行復測，復測結果呈核酸陽性反應則判定為核酸陽性，復測結果為核酸陰性反應則判為不確定結果，需進一步隨訪檢測。
（3）HIV核酸檢測陰性：只可報告本次實驗結果陰性。
（4）應在完成檢測後5個工作日內發出檢測報告。

㈧ 核酸檢測方法有哪些

核酸檢測採用咽拭子檢測，有口咽拭子采樣和鼻咽拭子采樣兩種方式。

口咽拭子采樣就是在咽喉部位用棉簽塗擦，刷取咽喉部位上皮細胞的檢測。受檢測者只要放鬆心情，張口發出「啊——」的聲音就可以了，檢測過程並沒有創傷風險，是非常安全的檢測。

檢測時可能會有惡心、想要嘔吐的不適感覺，不過這些不適症狀通常只需要半分鍾到兩分鍾左右就可以完全緩解了。鼻咽拭子采樣是將一根細棉簽深入鼻孔，從下鼻道深入抵達鼻咽後壁，然後捻轉棉簽取樣。棉簽進入鼻腔的深度約為鼻尖到耳垂的距離。

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核酸檢測相關知識：

核酸檢測是檢測病毒的方法，它可以更早發現感染。現在臨床中對乙肝、丙肝、艾滋病都開展了核酸檢測，可以在抗體產生前檢測到血液中是否存在病毒。而一些呼吸道疾病可以通過咽拭子或者呼吸道分泌物的核酸檢測來判斷是否感染，以及推測是否具有傳染性。

季節性流感、禽流感、冠狀病毒感染等通過咽拭子檢測可以方便地判斷出上呼吸道是否存在病毒成份，從而判斷被檢測者是否屬於感染者。

新冠病毒的核酸檢測已經是比較成熟的檢測方法了，只要在咽喉部位擦拭幾秒鍾就可以採集到標本。通過分析判斷是否有新冠病毒的核酸成分，可以盡早發現感染者，甚至在感染者出現症狀前就可以檢測到陽性。

感染者經過隔離治療後咽拭子檢測陰性說明病毒已經清除，不具有傳染性了。目前兩次咽拭子核酸檢測陰性是確診病例和無症狀感染者解除隔離的標准之一。

㈨ 核酸種類的檢測方法

現在一般使用高效液相色譜法來分析，常規的有紫外分光光度法，但是不如高效液相色譜法精確。