無連接酶的分子克隆方法有哪些

A. 分子克隆步驟

步驟：DNA片段的制備、載體的選擇、片段與載體連接。在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。

常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內得到復制與擴增，然後再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝。

片段的制備：

常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段③在已知蛋白質的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段④從mRNA反轉錄產生cDNA。

質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是「緊密型」；二是「鬆弛型」。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。

以上內容參考分子克隆

B. 分子克隆的方法

①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千鹼基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是「緊密型」；二是「鬆弛型」。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用於構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。
②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區，進行改造後組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統最適用於構建真核生物基因文庫和cDNA庫。
M13噬菌體是一種獨特的載體系統，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內是雙鏈環狀分子，象質粒一樣自主復制，制備方法同質粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈DNA，用於DNA順序分析、定點突變和核酸雜交。
③柯斯(Cos)質粒：是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質粒DNA分子。是噬菌體－質粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。 DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補鹼基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連接。④人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內切酶識別位點的寡核苷酸片段，經限制性內切酶作用後就會產生粘性末端。
連接反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質粒為載體時，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質粒為載體時，形成環狀分子，比率常為1∶1。 ①直接篩選：有些載體帶有可辨認的遺傳標記，能有效地將重組分子與本底區分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因後形成的噬菌斑就會從原來的混濁變為清亮；還有些載體分子攜帶外源基因後，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍色變為無色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段後便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的噬菌體均為重組分子。
②間接篩選：有引起載體分子帶有一個或多個抗葯性標記基因，當外源DNA插入到抗葯基因區後，基因失活，抗性消失。如一質粒有A和B兩個抗葯性基因，當外源基因插入到B基因區後，便只抗A葯而不抗B葯。因此能在A葯培養基上正常生長而不能在B葯培養上生長的便是重組分子。
③核酸雜交：廣泛用於篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑「印跡」到硝酸纖維膜等支持物上，變性後固定在原位，然後與標記的核酸探針進行雜交。陽性點的位置就是所需要的克隆。
④免疫學方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達，就可以用特異的蛋白質抗體為探針，進行原位雜交，選擇特異的克隆。

C. 分子克隆中常用的工具酶有哪幾種

工具酶：基因工程涉及眾多的工具酶可粗略的分為限制酶，連接酶，聚合酶，核酸酶和修飾酶五大類。其中，以限制性核酸內切酶和DNA連接酶在分子克隆中的作用最為突出。

1、DNA限制性內切酶

生物體內能識別並切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入並使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息；

2、連接酶

它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，藉助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵；

3、聚合酶

系專司生物催化合成脫氧核糖核酸和核糖核酸的一類酶的統稱；

4、核酸酶

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸，它可用於切去ds-cDNA合成中產生的發夾環；

5、修飾酶

體內有些酶可在其他酶的作用下，將酶的結構進行共價修飾，使該酶活性發生改變，這種調節稱為共價修飾調節。

D. 簡述DNA重組與分子克隆化基本原理與過程

（一）外源ＤＮＡ和質粒載體的連接反應
外源ＤＮＡ片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口（圖1.8），當雜本導入感受態細胞後可被修復。相鄰的５'磷酸和３'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的ＤＮＡ連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶。實際上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶都是首選的用酶。這是因為在下述反應條件下，它就能有效地將平端ＤＮＡ片段連接起來。
ＤＮＡ一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標准條件下，其反應速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位於同一ＤＮＡ分子（分子內連接）還是位於不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種ＤＮＡ，也就是用可產生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體ＤＮＡ。在加作用的底物。如果反應中ＤＮＡ濃度低，則配對的兩個末端同一ＤＮＡ分子的機會較大（因為ＤＮＡ分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高於找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。這樣，在ＤＮＡ濃度低時，質粒ＤＮＡ重新環化將卓有成效。如果連接反應中ＤＮＡ濃度有所增高，則在分子內連接反應發生以前，某一個ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ濃度高時，連接反的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）從理論上探討了ＤＮＡ濃度對連接產物性質的影響。簡而言之，環化的連接產物與多聯體連接產物的比取決於兩個參數：j和i。j是ＤＮＡ分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數值是根據如下一種假設作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈隨機捲曲。這樣，j與ＤＮＡ分子的長度成反比（因為ＤＮＡ越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對給定長度的ＤＮＡ分子來說是一個常數，與ＤＮＡ深度無關。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ長度，以cm計，b是隨機捲曲的ＤＮＡ區段的長度。b的值以緩沖液的離子強度為轉移，而後者可影響ＤＮＡ的剛度。
i是溶液中所有互補末端的深度的測量值，對於具有自身互補粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里Ｎo是阿佛伽德羅常數，Ｍ是ＤＮＡ的摩爾濃度（單位：mol/L)。理論上，當j=i時，給定ＤＮＡ分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當j>i時，有利於重新環化；當i>j，則有利於產生多聯體。圖1.9顯示了ＤＮＡ區段的大小與連接反應混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時所需ＤＮＡ濃度之間關系（Ｄugaiczyk等，1985）。現在考慮如下的連接反應混合物：其中除線狀質粒之外，還含有帶匹配末端的外源ＤＮＡ片段。對於一個給定的連接混合物而言，產生單體環狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的絕對濃度影響，而且還受質粒和外源ＤＮＡ末端的相對濃度的影響。當i是j的２－３倍（即末端的絕對濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時）外源ＤＮＡ末端濃度的２倍時，有效重組體的產量可達到最大。這些條什下，連接反應終產物的大約40％都是由單體質粒與外源ＤＮＡ所形成的嵌合體。當連接混合物中線性質粒的量恆定（j:i=3）而帶匹配末端的外源ＤＮＡ的量遞增時，這種嵌合體在連接反應之末的理論產量。
涉及帶粘端的線狀磷酸化質粒ＤＮＡ的連接反應應包含：
１）足量的載體ＤＮＡ，以滿足j:i>1和j:i<3。對一個職pUC18一般大小的質粒，這意味著連接反應中應含有載體ＤＮＡ為20-60μg/ml。
２）末端濃度等於或稍高於載體ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ濃度比載體低得多，在效連接產物的數量會很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉化菌落。這種情況下，可考慮採用一些步驟來減少帶非重組質粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質粒ＤＮＡ或發跡克隆策略以便通過定向克隆的方法構建重組質粒。
(二）粘端連接
１）用適當的限制酶消化質粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝膠電泳分離片段並（或）用鹼性磷酸酶處理質粒ＤＮＡ。通過酚：氯仿抽提和乙沉澱來純化ＤＮＡ，然後用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。
２）按如下所述設立連接反應混合物：
a．將0.1μl載體ＤＮＡ轉移到無菌微量離心管中，加等摩爾量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，於45℃加溫５分鍾以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。
c．加入：10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液 １μl
Ｔ４噬菌體ＮＤＡ連接酶 0.1Weiss單位
５mmol/L ATP 1μl
於16℃溫育１－４小時
10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫蘇糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白（組分Ｖ.Sigma產品）（可用可不用）
該緩訓液應分裝成小份，貯存於－20℃。
另外，再設立兩個對照反應，其中含有（１）只有質粒載體；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每個連接反應可用50-100ng質粒ＤＮＡ，並盡可能多加外源ＤＮＡ，同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少３種不同方法來測定Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的活性。大多數製造廠商（除New England Biolabs公司外）現在都用Weiss等，１1968)對該酶進行標化。１個Weiss單位是指在37℃下20分釧內催化１mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時，１個Weiss單位相當於0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位（Modrich和Lehman,1970)或者60個粘端單位（如Ｎew England Biolabs公司所定義）。因此，0.015Ｗeiss單位的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶在16℃下30分鍾內可使50％的λ噬菌體HindⅢ片段（5μg）得以連接。在本書中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶一律用Weiss單位表示。\par 目前提供的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶均為濃溶液（1-5單位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處於這種濃度並在這種緩沖液中的Ｔ４噬體ＤＮＡ連接酶於-20℃保存３個月可保持穩定。
３）每個樣品各取１－２μl轉化大腸桿菌感受態細胞。
（三）平端ＤＮＡ連接
Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶不同於大腸桿菌ＤＮＡ連接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的連接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由於ＤＮＡ很容易成為平端，所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相連。然而，相對而言，平端連接是低效反應，它要求以下４個條件：
１）低濃度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。
２）不存在亞精胺一類的多胺。
３）極高濃度的連接酶（50Weiss單位．ml）。
４）高濃度的平端。
１．凝聚劑
在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用並可導致ＤＮＡ分子凝聚成集體的物質，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高鈷（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得適當濃度的平端ＤＮＡ的總是迎刃而解。在連接反應中，這些物質具有兩作用：
１）它們可使平端ＤＮＡ的連接速率加大１－３個數量級，因此可使連接反應在酶ＤＮＡ濃度不高的條件下進行。
２）它們可以改變連接產物的分布，分子內連接受到抑制，所形成的連接產物一律是分子間連接的產物。這樣，即使在有利於自身環化（j:i=10）的ＤＮＡ濃度下，所有的ＤＮＡ產物也將是線狀多聚體。\par 在設立含凝聚劑的連接反應時，下列資料可供參考。
（１）聚乙二醇（PEG8000）
１）用去離子水配製的ＰＥＧ8000貯存液（40％）分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應混合物之前應將其融化並使其達到室溫。在含15％PEG 8000的連接反應混合物中，對連接反刺激效應最為顯著。除PEG 800和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應於０℃混合，然後加適當體積的PEG 8000（處於室溫），混勻，加酶後於20℃進行溫育。
２）連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時對連接反應的刺激效應最為顯著，甚至ATP濃度略有增加或ＭgCl2濃度略有降低，都會嚴重降低刺激的強度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。
３）濃度為15％的PEG 8000可刺激帶粘端的ＤＮＡ分子的連接效率提高至原來的10-100倍，反應的主產物是串聯的多聯體。
４）PEG 8000可刺激短至８個核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。
（２）氯化六氨合高鈷
１）氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存於-20℃，它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。當連接反應混合物中鹽深度為1.0-1.5μmol/L時，其刺激作用最大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50W部，但只能使端連接的效率提高到原來的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
２）在單價陽離子（30mmol/L KCl）存在下，它對平端連接仍有一定的刺激作用，但此時連接產物的分布有所改變。連接產物不再是清一色的分子間連接產物，相反，環狀ＤＮＡ將點盡優勢。
３）與ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。
（四）質粒載體中的快速克隆
質粒克隆中最慢的步驟是所需的外源ＤＮＡ片段和相應質粒ＤＮＡ區段的電泳純化，下面的操作方案[由S.Michaelis(個人通訊）根據Struhl(1985)的方法修訂而成]是從純化的凝膠中回收瓊脂糖塊，熔化後直接進行質粒和外源ＤＮＡ的連接。這一方法尋平端連接和粘端連接都同樣奏效，但需大量的連接酶，而且效率要比標准操作方案約低一個數量級。
１）用適當的限制酶消化外源ＤＮＡ，其量應足以產生約0.2μg的靶片段。反應體積應為20μl或更小。在另一管中，用相應的限制酶消化約0.5μg載體ＤＮＡ，總反應體積為20μl或更小。如載體ＤＮＡ帶相同的端，應用磷酸處理如下：用限制酶消化完全後，加2.5μl 100mmol/L Tris.Cl(pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25單位牛小腸鹼性磷酸酶，於37℃溫育30分鍾。
２）通過瓊脂糖凝膠電泳分離目標片段。務必用低熔點瓊脂糖灌制凝膠，務必用含溴化乙錠（0.5μg/ml）的１xTAE作為電泳緩沖液而不是常規的0.5xTBE來配製凝膠並進行電泳。
３）在長波長紫外照射下檢查凝膠，根據目標條帶的相對熒光強度估計所含ＤＮＡ的量（見附錄Ｅ）。用刀片切出目標條帶，盡可能少瓊脂糖的體積（通常40-50μl)。將切下凝膠片分別放入作好標記的各個微量離心管中。
４）於70℃加熱10-15分釧，使瓊脂糖熔化。
５）合並熔化的小份凝膠並放到加溫至37℃的中一管中，共終體積應不超過10μl,外源ＤＮＡ與質粒載體的摩爾比應接近２：１。
用另外兩個管設立兩個對照連反應，一個只含質粒載體，另一個只含外源ＤＮＡ片段。
６）將３個管於37℃溫育5-10分鍾，然後每管加10μl用冰預次的２xT４噬體ＤＮＡ連接酶混合物，在瓊脂糖凝固前，充他混勻各管內容物，於16℃溫育12-16小時。
２xT４噬菌體ＤＮＡ連接酶混合物可制備如下：
1mol/L Tris.Cl(pH7.6) 1.0μl
100mmol/L氯化鎂 1.0μl
200mmol/L三硫蘇糖醇 1.0μl
10mmol/L ATP 1.0μl
水 5.5μl
Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶 １Ｗeiss單位
混勻後放置於冰浴上。
７）連接反應行將結束時，取出貯存於-70的３管各200μl的凍存大腸桿菌感受態細胞
８）於70℃中熱10-15分鍾重新溶化連接混合物中的瓊脂糖。
９）立即從每管連接混全物中取出５μl加到200μl大腸桿菌感受態細胞中，小心搖晃，快速地混勻內容物。從剩下每管連接混合物中分別再取５μl重復以上步驟，將轉化混合物在冰浴上放置30分鍾。
10）完成轉化方案的其餘各步 分子克隆化是在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內得到復制與擴增，然後再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。克隆(clone,clon)一詞源於希臘文Klon，原意為樹木的枝條。在生物學中其名詞含義系指一個細胞或個體以無性繁殖的方式產生一群細胞或一群個體，在不發生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱無性繁殖(細胞)系；其動詞(clone,cloned,cloning)含義指在生物體外用重組技術將特定基因插入載體分子中，即分子克隆技術。將DNA片段(或基因)與載體DNA分子共價連接，然後引入寄主細胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為DNA和cDNA克隆兩類。cDNA克隆是以mRNA為原材料，經體外反轉錄合成互補的DNA(cDNA)，再與載體DNA分子連接引入寄主細胞。每一cDNA反映一種mRNA的結構，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特點是：①有些生物，如RNA病毒沒有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易篩選，因為cDNA庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一個mRNA的信息；③cDNA能在細菌中表達。cDNA僅代表某一發育階段表達出來的遺傳信息，只有基因文庫才包含一個生物的完整遺傳信息。分子克隆化-方法 (1)DNA片段的制備：常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段；③在已知蛋白質的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段；④從mRNA反轉錄產生cDNA。(2)載體DNA的選擇：①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千鹼基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是「緊密型」；二是「松馳型」。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用於構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區，進行改造後組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統最適用於構建真核生物基因文庫和cDNA庫。M13噬菌體是一種獨特的載體系統，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內是雙鏈環狀分子，象質粒一樣自主制復，制備方法同質粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈DNA，用於DNA順序分析、定點突變和核酸雜交。③拷斯(Cos)質粒：是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質粒DNA分子。是噬菌體－質粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。(3)DNA片段與載體連接：DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補鹼基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連接。④人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內切酶識別位點的寡核苷酸片段，經限制性內切酶作用後就會產生粘性末端。連接反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質粒為載體時，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質粒為載體時，形成環狀分子，比率常為1∶1。(4)引入寄主細胞：常用兩種方法：①轉化或轉染，方法是將重組質粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置於冰上，待DNA被吸收後鋪在平板培養基上，再根據實驗設計使用選擇性培養基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無轉化能力，而且重組後的DNA分子比原載體DNA分子大，轉化困難。②轉導，病毒類侵染宿主菌的過程稱為轉導，一般轉導的效率比轉化高。(5)克隆的選擇：①直接篩選：有些載體帶有可辨認的遺傳標記，能有效地將重組分子與本底區分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因後形成的噬菌斑就會從原來的混濁變為清亮；還有些載體分子攜帶外源基因後，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍色變為無色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段後便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的噬菌體均為重組分子。②間接篩選：有引起載體分子帶有一個或多個抗葯性標記基因，當外源DNA插入到抗葯基因區後，基因失活，抗性消失。如一質粒有A和B兩個抗葯性基因，當外源基因插入到B基因區後，便只抗A葯而不抗B葯。因此能在A葯培養基上正常生長而不能在B葯培養上生長的便是重組分子。③核酸雜交：廣泛用於篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑「印跡」到硝酸纖維膜等支持物上，變性後固定在原位，然後與標記的核酸探針進行雜交。陽性點的位置就是所需要的克隆。④免疫學方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達，就可以用特異的蛋白質抗體為探針，進行原位雜交，選擇特異的克隆。分子克隆化-重要意義 分子克隆技術是70年代才發展起來的，它的出現和應用開辟了分子遺傳學研究的新領域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創造新物種的大門。它的成就對於工業、農牧業和醫學產生深遠影響，並將為解決世界面臨的能源、食品和環保三大危機開拓一條新的出路。在醫學方面，利用分子克隆技術已將胰島素，人、牛和雞的生長激素、人的干擾素、松馳素、促紅細胞生長激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因製成工程菌，利用發酵工業進行了大規模生產。還可提高微生物本身所產生的蛋白酶類和抗生素類葯物的產量。在基因治療方面。通過遺傳工程看到癌細胞具有逆轉為正常細胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠腫瘤細胞，在溫度高時可逆轉為正常細胞。為治療半乳糖血症，用帶有大腸桿菌乳糖操縱子的λ噬菌體去感染半乳糖血症患者的離體培養細胞，發現這種細胞的半乳糖苷酶達到了正常水平，並確實能代謝半乳糖。在工業生產方面，以分子克隆技術為主體的基因工程、細胞工程、酶工程和發酵工程，四者緊密聯系、常綜合利用。許多化學試劑如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、環氧乙烷、烏頭酸和水楊酸等都可能利用分子克隆技術得到產品。在環境保護方面，人們根據需要進行基因操作，將某種微生物的基因轉入另一微生物，創造一些對有害物質降解能力更強的新菌種，以分解工業污水中的有毒物質。在食品工業方面，細菌可為人類生產有價值的蛋白質、氨基酸和糖等。在農業生產方面，植物遺傳工程對提高農作物的產量、培育新的農作物品種提供了可能。有許多外源基因導入植物獲得成功。

E. 分子克隆的基本方法

載體所謂載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。

基因庫的建造

特異基因的篩選
核酸序列測定

一、基因克隆的基本方法

一個典型的基因克隆實驗，主要有以下操作和結果：

（1）包括有目的基因在內的DNA片斷插入另一個DNA分子（克隆載體，通常是環狀的），形成重組DNA分子。

（2）重組DNA分子通過轉化或其他類似的方法被導入受體細胞。大腸桿菌是使用較多的受體細胞。

（3）在受體細胞中，克隆載體指導重組DNA分子復制，產生許多完全相同的拷貝。

（4）當受體細胞分裂時，重組DNA分子的拷貝進入子細胞，克隆載體的復制將在子細胞中繼續。

（5）大量分裂的受體細胞形成克隆：一個細胞群體，其中每個細胞都含有許多重組DNA分子的拷貝。

顯而易見，基因克隆是一個比較直觀而簡單的操作程序。它之所以具有非常重要的生物學意義，是因為這一技術可以為我們提供一個純粹的基因標本。通常，一個基因總是和細胞里其他基因同在。基因克隆技術誕生之前，我們根本無法純化單個基因，這意味著我們只能對基因群、而不是特定基因的結構與功能進行研究和開發利用。

１、重組DNA分子的構建

構建重組DNA分子是基因克隆實驗的第一步，亦即，把環狀的載體在指定部位切斷，然後把含目的基因的DNA分子插入其中，再將兩者連接起來。這一過程需要兩種DNA操作酶：限制性內切酶（restriction endonucleases）和連接酶（ligases）。

限制性內切酶能夠識別DNA分子上的特定核苷酸序列，並在該處特異性切斷DNA分子。例如，PvuI（細菌Proteus vulgaris分離）只識別和切斷6核苷酸序列CGATCG；從相同細菌分離的PvuII，卻只識別並切斷CAGCTG。許多限制性內切酶的識別位點是6個核苷酸，但是，也有識別4個或5個、甚至8個核苷酸順序的限制性內切酶。此外，有些限制性內切酶的識別順序可能不是唯一的，例如，HinfI可以識別並切斷GAATC、GATTC，GAGTC和GACTC。因此，通常也將HinfI的識別位點記為GANTC，N代表A、T、G和C中的任意一種核苷酸。

經限制性內切酶處理後的DNA分子斷端有兩種：平端和粘端，它們的性質對基因克隆的實驗設計有重要影響。其中，具有不同識別位點的限制性內切酶可以產生相同的粘端。例如，BglII（AGATCT）和BamHI（GGATCC）產生與Sau3A相同的GATC粘端。顯然，經上述三種酶處理的DNA分子片斷之間均可以在相應的斷端形成互補雙鏈。

DNA分子片斷通過粘端形成的鹼基互補並不能使之相互連接，後一過程需要連接酶的催化作用。所有生物細胞中都產生連接酶，但是，基因克隆中最常用的是T4噬菌體的連接酶。連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。由於平端不能使DNA片斷保持相互接近的位置，因而，和粘端相比，連接酶對平端DNA分子之間連接反應的催化效率較差。

２、克隆載體及其主要功能

F. 分子克隆中常用的連接方法及原理

方法：DNA片段的制備、載體的選擇、片段與載體連接。在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。

原理：外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。

但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞後可被修復。

載體DNA的選擇

質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千鹼基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是「緊密型」；二是「鬆弛型」。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用於構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。

以上內容參考：網路-分子克隆

G. 分子克隆中常用的連接方法

方法：DNA片段的制備、載體的選擇、片段與載體連接。在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。

基因克隆是一個比較直觀而簡單的操作程序。它之所以具有非常重要的生物學意義，是因為這一技術可以為我們提供一個純粹的基因標本。

通常，一個基因總是和細胞里其他基因同在。基因克隆技術誕生之前，我們根本無法純化單個基因，這意味著我們只能對基因群、而不是特定基因的結構與功能進行研究和開發利用。

重要意義與應用

分子克隆技術是70年代才發展起來的，它的出現和應用開辟了分子遺傳學研究的新領域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創造新物種的大門。它的成就對於工業、農牧業和醫學產生深遠影響，並將為解決世界面臨的能源、食品和環保三大危機開拓一條新的出路。

H. 基因克隆的基因克隆技術

基因克隆技術包括了一系列技術，它大約建立於70年代初期。美國斯坦福大學的伯格（P.Berg）等人於1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內切酶切割後，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，於是產生了一種新的重組DNA分子，從此產生了基因克隆技術。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段與質粒DNA連接起來，構成了一個重組質粒，並將該重組質粒轉入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。
一般來說，基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組DNA，然後送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。因此基因克隆技術又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術以及基因工程等。
採用重組DNA技術，將不同來源的DNA分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程叫基因克隆。 基因工程的載體應具有一些基本的性質：1）在宿主細胞中有獨立的復制和表達的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴增。2）分子量盡可能小，以利於在宿主細胞中有較多的拷貝，便於結合更大的外源DNA片段。同時在實驗操作中也不易被機械剪切而破壞。3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗葯性標記基因），以賦予宿主細胞的不同表型特徵（如對抗生素的抗性）。4）載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點是位於檢測表型的標記基因之內可造成插入失活效應，則更有利於重組子的篩選。
DNA克隆常用的載體有：質粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage），柯斯質粒載體（cosimid），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNA phage ），噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。 體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割DNA分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連接。當目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比黏端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端DNA分子通過一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連接，此為修飾黏末端連接。
導入受體細胞
載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的復制起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中復制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。
將外源重組DNA分子導入原核宿主細胞的方法有轉化（transformation），轉染（transfection），轉導（transction）。重組質粒通過轉化技術可以導入到宿主細胞中，同樣重組噬菌體DNA可以通過轉染技術導入。轉染效率不高，因此將重組噬菌體 DNA或柯斯質粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，藉助這些噬菌體顆粒將重組DNA分子導入到宿主細胞轉導技術，這種轉導技術的導入效率要比轉染的導入效率高。 從不同的重組DNA分子獲得的轉化子中鑒定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：
（一）插入失活法
外源DNA片段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質粒）。
（二）PCR篩選和限制酶酶切法
提取轉化子中的重組DNA分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過PCR技術篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。
（三）核酸分子雜交法
制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（四）免疫學篩選法
獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
上述方法獲得的陽性克隆最後要進行測序分析，以最終確認目的基因。

I. 基因克隆常見方法

、T4連接酶介導的DNA克隆

傳統的分子克隆，通常需要使用相同的限制性內切酶酶切載體和目的片段，使得載體和片段產生相同的粘性或平末端，使用T4 DNA連接酶對其進行連接，轉化，挑取陽性克隆，得到重組質粒

為了更方便的對DNA進行克隆，後續又將克隆的載體進行了簡化，出現了T載體，這樣就可以不用酶切，直接將片段連接到載體上，以便於DNA的保存及後續擴增。

以TA克隆為例來介紹整個連接過程。常規的連接是一個三分子共同反應的過程（圖1），載體、片段和連接酶碰撞在一起，發生反應，完成連接過程。為了得到更多的陽性克隆，我們會傾向於加入更多的片段、載體和連接酶，以提高分子碰撞機率，但同時也會遇到一個問題，過高的DNA濃度和T4連接酶濃度會增加分子間相互作用促進串聯體和載體自連的形成，反而導致片段和酶的利用率降低。所以在進行TA克隆時，並不是DNA和酶加入的越多越好。

使用這種方法進行克隆，如果需要連接平末端的DNA片段（比如Pfu類酶擴增的片段），則需要進行額外的加A尾反應（可以使用Taq酶完成加A）

二、EASY克隆

EASY克隆的方法主要依賴於載體上所攜帶的拓撲異構酶。拓撲異構酶的生理作用主要體現在DNA復制的過程中，同時具有內切酶和連接酶的功能：酶切釋放DNA復制過程中產生的螺旋力；在復制完成後，將缺口補上，完成DNA的復制。很多拓撲異構酶無明顯特異性結合DNA序列的規律，直到1990年，科學家舒曼在牛痘病毒中發現了一種拓撲異構酶能特異性識別C/TCCTT序列（圖2），並對後面序列進行切割和連接，才使得拓撲異構酶用於DNA克隆成為可能。

圖2 左圖：拓撲異構酶識別特定的序列；右圖：拓撲異構酶介導的基因克隆

EASY克隆就是基於這一原理，將T鹼基通過磷酸鍵與拓撲異構酶第274位酪氨酸結合，使拓撲異構酶和載體偶聯在

J. 目標基因克隆的主要方法有哪些

基因克隆技術包括了一系列技術，它大約建立於70年代初期。美國斯坦福大學的伯格（P.Berg）等人於1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內切酶切割後，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，於是產生了一種新的重組DNA分子，從此產生了基因克隆技術。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段與質粒DNA連接起來，構成了一個重組質粒，並將該重組質粒轉入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。
一般來說，基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組DNA，然後送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。因此基因克隆技術又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術以及基因工程等。
採用重組DNA技術，將不同來源的DNA分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程叫基因克隆。