革蘭染色實驗方法與步驟

① 革蘭染色的關鍵步驟是什麼

脫色時間的掌握，是革蘭染色成敗的關鍵。

革蘭氏染色四大基本步驟：結晶紫初染、碘液媒染、乙醇脫色、沙黃復染，其中乙醇脫色是關鍵。因為如果脫色過度，有可能會使革蘭氏陽性菌呈假陰性，如果脫色不夠，有可能使革蘭氏陰性菌呈假陽性。

革蘭氏染色是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯緻密，革蘭氏染色屬復染法，即將標本固定後，先用龍膽紫染色，加碘液媒染後用酒精脫色，再用蕃紅復染。

拓展資料：

革蘭染色法，由丹麥病理學家Christain Gram於1884年創立，是細菌學中很重要的鑒別染色法，因為通過此法染色，可將細菌鑒別為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）兩大類。

如果將細菌做革蘭染色，凡是染後菌體呈藍紫色的，稱為「革蘭陽性菌」；菌體是伊紅色，稱「革蘭陰性菌」。無論陽性菌還是陰性菌，都有桿菌和球菌。

葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌是臨床最為常見的病原菌，葡萄球菌屬於革蘭陽性菌，大腸桿菌屬於革蘭陰性菌中的腸桿菌科，除大腸桿菌以外，臨床較常見的腸桿菌科細菌還有變形桿菌屬，沙門菌屬、克霉白菌屬；銅綠假單胞菌是臨床常見的較耐葯革蘭陰性桿菌。

參考資料：革蘭染色_網路

② 革蘭氏染色的實驗方法

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：
1）塗片固定。
2）草酸銨結晶紫染1分鍾。
3）自來水沖洗。
4）加碘液覆蓋塗面染約1分鍾。
5）水洗，用吸水紙吸去水分。
6）加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，20秒後水洗，吸去水分。
7）蕃紅染色液（稀）染1分鍾後，自來水沖洗。乾燥，鏡檢。 通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯緻密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
染色的差異主要是由於陰性與陽性細菌細胞壁的差異所引起的。
①革蘭氏陽性細菌的細胞壁
G+細菌細胞壁具有較厚（20-80nm）而緻密的肽聚糖層，多達50層，占細胞壁成分的40%～95%，它同細胞膜的外層緊密相連（圖2-9）。有的G+細菌細胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也稱胞壁質（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由於磷壁酸帶負電荷，它在細胞表面能調節陽離子濃度。磷壁酸與細胞生長有關，細胞生長中有自溶素（autolysins）酶類起作用，磷壁酸對自溶素有調節功能，阻止胞壁過度降解和壁溶。
如果細胞壁的肽聚糖層被消溶，G+細胞成為原生質體（protoplasts），細胞壁不復存在，而只存留細胞膜。除鏈球菌外，大多數G+細菌細胞壁中含極少蛋白質。
②革蘭氏陰性細菌的細胞壁 G—細菌細胞壁比G+細菌細胞壁薄（15～20nm）而結構較復雜，分外膜（outer membrane）和肽聚糖層（2～3nm）（圖2-10）。在細胞壁和細胞質膜之間有一個明顯的空間，稱為壁膜間隙（periplasmic space）。
外膜 G—細菌細胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同細胞質膜相同之處也是雙層類脂，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質。
LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復分支的碳水化合物分子組成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脫氧已糖。由於糖的種類不同，使各種G—細胞具有不同特性的LPS。核心多糖（core polysaccharide）的主要組分是酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。
外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），調控外界分子進入細胞；有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體；許多G—細菌對高等生物有致病性是由LPS的成分決定的，它的毒性組分常稱為內毒素（endotoxins）。
肽聚糖層 G—細菌細胞壁的肽聚糖層很薄，在大腸桿菌和其它細菌中僅有單
層。肽聚糖層和外膜的內層之間通過脂蛋白連接起來。
壁膜間隙 G—細菌細胞壁的外膜與細胞質膜之間存在明顯的壁膜間隙，一層薄的肽聚糖處於其間，肽聚糖層和細胞質膜之間的間隙較寬，肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12～15nm，呈膠腖態。其間含有三類蛋白質：水解酶，催化食物的初步降解；結合蛋白，啟動物質轉運過程；化學受體（chemoreceptors），在趨化性中起作用的蛋白。 革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

③ 革蘭氏染色的關鍵步驟是什麼

酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

（1）載玻片固定。在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌於干凈的載玻片上塗布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種並使其粘附固定。

（2）草酸銨結晶紫染1分鍾。

（3）自來水沖洗，去掉浮色。

（4) 用碘-碘化鉀溶液媒染1分鍾，傾去多餘溶液。

（5）用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。

（6）用蕃紅染液或者沙黃復染30秒，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區別開。

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染色原理：

該染色法所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低。

故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易於滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染後就成紅色。

G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理後反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色，呈現藍紫色。

④ 革蘭染色法的步驟、結果及其臨床意義分別是什麼

一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：1）塗片固定。2）草酸銨結晶紫染1分鍾。3）自來水沖洗。4）加碘液覆蓋塗面染約1分鍾。5）水洗，用吸水紙吸去水分。6）加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，20秒後水洗，吸去水分。7）蕃紅染色液（稀）染1分鍾後，自來水沖洗。乾燥，鏡檢。
具體試驗 流程
1、 取載玻片用紗布擦乾，載玻片的一面用marker筆畫一個小圈（用來大致確定菌液滴的位置）。塗菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、 塗片：液體培養基：左手持菌液試管，在酒精燈火焰附近5cm左右打開管蓋；右手持接種環在火焰中燒灼滅菌，等冷卻後從試管中沾取菌液一環，在潔凈無脂的載玻片上塗直徑2mm左右的塗膜，最後將接種環在火焰上燒灼滅菌。固體培養基：先在載玻片上滴一滴無菌水，再用接種環取少量菌體，塗在載玻片上，使其薄而均勻。 3、 晾乾：讓塗片在空氣中自然乾燥。 4、 固定：讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）。 5、 染色：將固定過的塗片放報紙上，滴加草酸銨結晶紫液，染1min。 6、 水洗：用水緩慢沖洗塗片上的染色液，用吸水紙吸干。簡單染色結束可觀察細胞形態。 7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、 脫色：吸去殘留水，連續滴加95%乙醇脫色20-30s至流出液無紫色，立即水洗。 9、 復染：滴加蕃紅復染3-5min，水洗。至此，革蘭氏染色結束。

結果：革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

其重要的臨床意義在於：1.鑒別細菌 2.選擇葯物 3.與致病性有關：革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素；而內毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂多糖，兩者的致病作用不同。

⑤ 革蘭氏染色都有哪幾個步驟

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟,具體操作方法是：
1）塗片固定.
2）草酸銨結晶紫染1分鍾.
3）自來水沖洗.
4）加碘液覆蓋塗面染約1分鍾.
5）水洗,用吸水紙吸去水分.
6）加95%酒精數滴,並輕輕搖動進行脫色,20秒後水洗,吸去水分.
7）蕃紅染色液（稀）染2分鍾後,自來水沖洗,乾燥,鏡檢.

⑥ 簡述革蘭氏染色的步驟和結果

塗片固定，草酸銨結晶紫染1分鍾，蒸餾水沖洗，加碘液覆蓋塗面染約1分鍾，水洗，用吸水紙吸去水分，加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，20秒後水洗，吸去水分，蕃紅染色液（稀）染1分鍾後，蒸餾水沖洗。乾燥，鏡檢。

染色結果：革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

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臨床意義

其重要的臨床意義在於：

1、鑒別細菌；

2、選擇葯物；

3、與致病性有關：革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素；而內毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂多糖，兩者的致病作用不同。

可能誤差

在實驗中經常會出現假陽性和假陰性的結果，假陽性主要是由於脫色不完全，可能是由於塗片過厚，或者是結晶紫染色過度，導致脫色不完全。

假陰性可能是因為細胞固定過度，造成細胞壁通透性的改變，而出現假陰性結果；另外，細胞培養時間太長，可能已經有部分細胞發生死亡或者自溶，也導致細胞壁通透性的改變而出現假陰性結果。

⑦ 「革蘭氏染色」的操作步驟是什麼

革蘭氏染色法具體操作步驟：

1. 塗片固定。

2. 草酸銨結晶紫染1分鍾。

3. 純化水沖洗。

4. 加碘液覆蓋塗面染1分鍾。

5. 水洗，用吸水紙吸去水分。

6. 加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，30秒後水洗，吸去水分。

7. 番紅染色液（稀）染10秒鍾後，純化水沖洗。乾燥，鏡檢。

⑧ 簡述革蘭氏染色的操作步驟

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

1）塗片固定。

2）草酸銨結晶紫染1分鍾。

3）蒸餾水沖洗。

4）加碘液覆蓋塗面染約1分鍾。

5）水洗，用吸水紙吸去水分。

6）加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，20秒後水洗，吸去水分。

7）蕃紅染色液（稀）染1分鍾後，蒸餾水沖洗。乾燥，鏡檢。

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革蘭氏染色法的意義就在於鑒別細菌，把眾多的細菌分為兩大類，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。

在治療上，大多數革蘭氏陽性菌都對青黴素敏感（結核桿菌對青黴素不敏感）：大多數化膿性球菌都屬於革蘭氏陽性菌，它們能產生外毒素使人致病，可以選擇青黴素族，頭孢曲松鈉等。

革蘭氏陰性菌，大多數腸道菌多屬於革蘭氏陰性菌，它們產生內毒素，靠內毒素使人致病。而革蘭氏陰性菌則對青黴素不敏感，可以選擇氟喹諾酮類葯物如諾氟沙星，左氧氟沙星等，也可以選擇大環內酯類比如克拉黴素、羅紅黴素等。所以首先區分病原菌是革蘭氏陽性菌還是陰性菌，在選擇抗生素方面意義重大。

⑨ 革蘭氏染色的步驟和原理

原理：革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。該染色法之所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是因為一般認為革蘭氏染色是基於細菌細胞壁特殊化學組分進行染色的。

步驟：

(一)塗片固定

在干凈的載玻片中央滴加一滴蒸餾水，用接種環進行無菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成菌懸液並塗布成直徑約1cm的薄層。

(二)染色

在固定過的塗片菌膜上滴加草酸銨結晶紫染液，染色液應完全覆蓋整個菌膜，染色1min。

(三)水洗

染色到一定的時間，拿住玻片使之成450角，用細小的水流把多餘的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。

(四)媒染

加碘液覆蓋塗面染1 min。在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性的化合物，可增加染料和細菌的親和力。

(五)水洗，用吸水紙吸去水分

用細小的水流緩慢沖洗塗片上的染色液，用吸水紙吸干。

(六)脫色

加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色， 20 s~30 s後再進行水洗，吸去水分。

(七)復染

蕃紅染色液染色10 s後， 自來水沖洗。

(八)乾燥，鏡檢

染色的結果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。

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標本乾燥後即進行固定，固定的目的有三個：

(1)殺死微生物，固定細胞結構。

(2)保證菌體能更牢固的粘附在載玻片上，防止標本水洗時被水沖洗掉。

(3)改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易於染色。

⑩ 革蘭氏染色步驟是什麼

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

1、塗片固定。

2、草酸銨結晶紫染1分鍾。

3、蒸餾水沖洗。

4、加碘液覆蓋塗面染約1分鍾。

5、水洗，用吸水紙吸去水分。

6、加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，20秒後水洗，吸去水分。

7、蕃紅染色液（稀）染1分鍾後，蒸餾水沖洗。乾燥，鏡檢。

原理

通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯緻密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙；

因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

以上內容參考：網路-革蘭氏染色