从组织细胞中获得酶的粗提纯样品有哪些方法

❶ 酶进行提纯的方法是什么

酶，从动植物细胞和微生物中提取之后，往往不能直接应用，这是因为生物在合成酶的同时也合成其他大分子物质。而这些大分子物质会严重干扰酶的作用，因此必须把酶从中分离出来。如果酶不纯，那么极有可能在应用中形成几个生化反应同时进行，结果得到的产物也就不是单一的。当然，酶并不是越纯越好。不同的生物化学反应，对酶的纯度要求也不一样。因此，要把酶制成不同的酶制剂，以便适应各种需求。

要对酶进行分离和提纯，有多种方法。当酶从生物细胞以及微生物中产生之后，可能留在细胞内，也可能分泌到细胞外面。如果是胞外酶，这就方便多了，只要收集微生物和细胞的培养液进行分离和提纯就可以了。如果酶在细胞内(称胞内酶)，则必须研碎细胞，才能把酶提取出来。不论是胞外酶还是胞内酶，都可能会含有一些其他大分子物质，如核酸、蛋白质和淀粉之类的东西。

对付核酸，只要在酶溶液中加入核酸酶，就可以去掉核酸。对于淀粉也比较好办。最难对付的是蛋白质，因为酶也是蛋白质，能破坏蛋白质的方法也可以破坏酶，所以提纯是件比较困难的事。但随着现代科学技术的不断进步，经过研究，已找到沉淀法、分子过滤法等。采用以上提纯方法，就可以得到不同纯度的酶，这为酶的广泛应用打开了方便之门。

❷ 常用酶的提取方法有哪些并解释提取机理

血中DNA的提取血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料,在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA.因此,从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一,破坏红细胞,通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异,先使红细胞裂解,经离心后收集白细胞；第二,白细胞裂使膜蛋白和核蛋白变性,游离DNA,通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三,除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质,使DNA留在上清液中；第四,在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出. 取材 取外周血5ml,EDTA抗凝 1.新鲜抗凝血,离心弃去上清液； 2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液,按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入6-10ml裂解液）,轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方： NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml; Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌, 用时加10-20ml 3.800-1000rpm离心5-8分钟,离心弃去上层红色清液； 4.收集沉淀部分,加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次； 5.如裂解不完全可重复步骤2和3； 6.重悬细胞,用于后续实验；提取DNA,最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行. 酚氯仿方法提取DNA 在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础.是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的.这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验. 原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏. 一、试剂准备 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0). 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl. 3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml. 4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理 1．白细胞处理 ⑴ 取红细胞裂解完全后收集的沉淀,加入0.5ml TE ⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中. ⑶ 加20% SDS 25 μl,蛋白酶K (2mg/ml) 25 μl,混匀. ⑷ 60°C水浴1-3hr. 2．培养细胞处理： ⑴ 将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次. ⑵ 离心4000g×5min,去除上清液. ⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液. ⑷ 50-55°C水浴1-2hr. （二）DNA提取 1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min. 2. 离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中. 3. 加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中. 4. 加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.如水相仍不澄清,可重复此步骤数次. 5. 加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中. 6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀. 7. 待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液. 8. 沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min ,弃上清液. 9. 室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜. (三）DNA定量和电泳检测 1.DNA定量： DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处.因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA.如用1cm光径,用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000. DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度.若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在.OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在. 2.电泳检测：取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳,检测DNA的完整性,或多个样品的浓度是否相同.电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带. 三、注意事项 1. 所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶. 2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制. 3. 用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性. 4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的.如要求更高,可参考有关资料进行DNA纯化.

❸ 如何将酶从细胞中分离

植物细胞有坚韧的细胞壁，需要强烈的方法去破碎，少量样品可用研钵加石英砂研磨，或用玻璃匀浆器。大量样品则需用电动匀浆器。为减低研磨或匀浆过程中发热，所用器皿和溶液需要预冷，提取液的用量一般为组织的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般宁可用量小些，将残渣再提取一次。提取匀浆时加入酚类结合剂PVPP，金属螯合剂 Na2─EDTA，以及─SH化合物以保护蛋白质，或加入非离子型去垢剂如Triton X─100，以增加蛋白质的可溶度，常用于与膜脂结合的酶。总之，可以通过试验以确定提取蛋白质的最佳条件。

❹ 酶分离提纯的方法有哪些

酶是蛋白质，因此一般蛋白质的分离原则都应该遵行。但酶作为特殊的蛋白质，最重要的原则是一定在纯化过程中保持酶的活性，所以纯化过程中一般要注意保持低温、缓冲液配方避免酶的抑制。每个步骤都要检测酶活性，一方面直观了解纯化的回收率，另一方面可以计算酶的纯度。
酶的分离纯化方法一般根据酶的分子量、等电点、疏水性等生化性质，选择相应的沉淀、盐析、层析方法，其中亲和层析可以应用可逆性底物作为配基或特异性抗体，制备亲和层析胶。

❺ 从各种组织细胞中获取酶的方法

从动物胰脏中提取胰蛋白酶,一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来,然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH三.0左右）,使大量的酸性蛋白沉淀出来.经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀.沉淀物经水溶解并调至pH吧.0,用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活,同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活,三种酶原相互作用过程如下： 也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原,利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶,并通过溶液中Ca二+的环境,使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活,转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）. 激活后的酶溶液再进一步分离纯化. 〔试剂和器材〕 一、试剂 （一）pH二.三.0乙酸化的水溶液 （二）一0%（体积分数）乙酸 （三）二mol/L硫酸 （四）固体硫酸铵 （5）无水CaCl二 （陆）结晶胰蛋白酶 （漆）二5%乙醇溶液(含0.0一5mol/LHCl 、0.05mol/LCaCl二) （吧）95%（体积分数）乙醇 （9）5mol/L NaOH （一0）丙酮 二、器材 （一）胰脏 （二）组织捣碎机 （三）离心机 （四）磁力搅拌器 （5）透析袋、二0目筛中国、纱布、水浴锅 （陆）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗 （漆）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等 〔方法和步骤〕 方法一 一、 胰蛋白酶原的提取 取新鲜胰脏约一50g,剥去结缔组织和脂肪,取净重一00g,切成碎块,在组织捣碎机中捣碎,并加入二倍体积预冷的pH二.三.0乙酸化水溶液,制成匀浆.浆液倒入500mL烧杯中,用一0%（体积分数）乙酸调节pH在二.三.0之间,在5～一0℃下提取陆h以上,并间隙轻轻搅拌.用四层纱布过滤,尽量挤出滤液.组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH二.三.0乙酸化水溶液再提取一次（放置一～二h）,再用四层纱布过滤.合并两次滤液,用二.5mol/L硫酸调节滤液pH在二.三.0之间,四℃放置四h（pH始终保持在二.三.0）,使提取液中酸性蛋白沉淀析出.提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤,收集滤液,量取体积（约二00mL左右）. 滤液中加入粉末状固体硫酸铵,使溶液达0.漆5饱和度（每升滤液加四9二g,5℃）.放置过夜,使胰蛋白酶原完全析出.次日抽滤,弃滤液,压紧并收集滤饼,即胰蛋白酶原粗品. 二、 胰蛋白酶原的激活 将胰蛋白酶原粗品称重（湿重）,分次加入一0倍体积预冷的蒸馏水（按滤饼重量计算）,使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重一/四）.用5mol/L NaOH将溶液调至pH吧.0,慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl二使溶液的Ca二+终浓度达到0.一mol/L（要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫酸钙的钙离子）.取出二mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性.原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶,轻轻搅拌均匀,二5℃放置二～四h,或四℃放置一二～一陆h,使胰蛋白酶原活化.每隔一h取样测定胰蛋白酶活性增长情况,直至酶激活速度变慢或停止增长.一般比活可达到三 500～四 000 BAEE单位/mg.留取二mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性.激活酶溶液用二mol/L硫酸调pH至二.三.0,滤纸过滤,滤去硫酸钙沉淀,收集滤液,四℃保存备用. 方法二 称取冷冻猪胰脏一00g,在二～5℃下解冻,切成小块,用组织捣碎机中绞碎成胰浆,在5～一0℃存放二四h以上,使胰酶自身活化.胰浆中加入二5%（质量分数）乙醇溶液二50mL（二5%乙醇溶液中加0.0一5mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl二）,捣碎机中捣碎一min.胰浆倒入500mL烧杯中,间隙搅拌,温度二0℃左右,活化5～陆h.每隔一.5h,吸取二mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性. 活化反应结束后,胰浆三 500 r/min离心二0min,将离心后上清液用二层纱布过滤.滤液置二50mL烧杯中,以过滤清液的体积为准,加入粉末状硫酸铵,搅拌溶解,使溶液硫酸铵饱和度为二0%.放置 陆h后,三 500 r/min离心二0min,保存上清液待用,取沉淀.沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤,再用丙酮洗涤,过滤.最后将沉淀置于表面皿上自然干燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅰ. 在上述离心上清液中,加入粉末状硫酸铵,搅拌溶解,使上清液溶液达到55%硫酸铵饱和度,放置 陆h后,三 500 r/min离心三0min,取离心沉淀,分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤,过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅱ

❻ 提取酶的方法有哪些

酶是蛋白质，可以根据其特点选择适当的蛋白质提取纯化方法！

选择材料及预处理

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

蛋白质的分离纯化

一，蛋白质（包括酶）的提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显着影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）

（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法

亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

浓缩、干燥及保存

一、样品的浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：

膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径

XM－300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

二、干燥

生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。

三、贮存

生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

❼ 酶的分离和纯化方法是什么

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。

酶分离纯化的最终目的是获得单一纯净的酶，因此，容许在不破坏“目的酶”的限度内，使用各种手段;酶与底物和抑制剂的结合常使其理化性质和稳定性发生改变，这种特性已被用于酶的分离纯化。

由于酶及其来源的多样性及与之共存的高分子物质的复杂性，目前还很难找到一种通用的方法以适用于一切酶的纯化。为了使一种酶达到高度纯化，往往需要多种方法协同作用，通过酶活性的跟踪检测确定最佳流程。

(7)从组织细胞中获得酶的粗提纯样品有哪些方法扩展阅读：

酶的本性是蛋白质，凡可用于蛋白质分离纯化的方法都同样适用于酶，但酶易失活，故分离纯化需在低温(4℃)、温和pH(4<pH>10)等条件下进行。

与蛋白质类似，酶易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，因此操作中应尽量减少泡沫形成，此外重金属易使酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称是分离纯化。

❽ DNA粗提取实验步骤

一 教学目的
1.初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。
2.观察提取出来的DNA物质。
二 教学建议
在本实验的教学中，教师应注意以下几点。
1.实验材料必须准备充足。本实验所用的实验材料是鸡血细胞液,由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组(2个学生)需用5 mL 鸡血细胞液,则每班(50人)至少需要130 mL,而鸡血细胞液与鸡血的体积比为1:3,这样每班至少需要390 mL 鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡,一般可得120 mL 左右的鲜血,因此,1个班实验需要买4只活鸡。如果不具备购买活鸡的条件,也可以到市场售活鸡处去索取鸡血,但所带烧杯中必须提前放入抗凝剂。
2.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程中DNA的损失。
3.获取较纯净的DNA的关键步骤。
(1)充分搅拌鸡血细胞液DNA存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后,必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌,使鸡血细胞加速破裂,并释放出DNA。
(2)沉淀DNA时必须用冷酒精实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精,并在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。
(3)正确搅拌含有悬浮物的溶液实验步骤3、5、7,都需要用玻璃棒搅拌。教师应提醒学生注意,在进行步骤3、5时,玻璃棒不要直插烧杯底部,而且搅拌要轻缓,以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时,要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间,用手缓慢转动510 min。
三 参考资料
实验原理的补充介绍
1.DNA的释放 DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。
2.将DNA与蛋白质分离 根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。
3.DNA的析出与获取 利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好,用4 000 r/min 的旋转频率,离心15 min ,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA。
4.DNA的再溶解 再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。
5.DNA的沉淀和浓缩 除去了蛋白质的核酸溶液,必须再进一步沉淀和浓缩。最常用的方法是酒精沉淀法。就是将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分。浓缩后的DNA丝状物,可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。
6.DNA的鉴定 本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法(配方见下述的“药品配制”)。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。
鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。
二苯胺试剂的配制
A液： 15 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。
B液： 乙醛的体积分数为0.2%的溶液。
配制： 将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。
DNA粗提取与鉴定的另一种方法
1.材料用具
新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。
塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏斗,酒精灯,石棉网,三角架,火柴,刀片,天平。
研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,二苯胺试剂,蒸馏水。
2.方法步骤
(1)DNA的粗提取
①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h。
②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放置几分后,再取上清液。
⑤加冷酒精 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。沉淀35 min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。
(2)DNA的鉴定
①配制二苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀。
②鉴定 取4 mL DNA提取液放入试管中,加入4 mL 二苯胺试剂,混匀后观察溶液颜色(不变蓝)。用沸水浴(100 ℃)加热10 min 。在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色)。
研磨液的配制方法
Tris：10.1 g(相对分子质量为121.14),先加50 mL 蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 moL/L 的盐酸调至pH8.0,再加下述药品。
NaCl：8.76 g(相对分子质量58.44)
EDTA：37.2 g(相对分子质量372.24)
SDS：20 g(相对分子质量288.3)
待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL。
若在室温低于20 ℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用。
研磨液中几种药品的作用
SDS(十二烷基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离。
EDTA(乙二胺四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。
物质的量浓度为0.15 moL/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA。
Tris/HCl：提供缓冲体系,DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。(Tris为三羟甲基氨基甲烷)
鉴定DNA的其他方法 用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好。具体鉴定方法如下。
1.配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液。
2.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色。
3.将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处)。