mic药敏检测方法

① 动物药敏试验中药物不敏感的原因有那些

兽医临床中的药敏试验
目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。
一、什么是药敏试验？
抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。

二、药敏试验的意义
1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。是一种既经济又有效的方法。
2、可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。
3、为临床用药提供参考依据。因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。根据已进行的大量药敏试验结果，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株。这是一个非常危险的信号。所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。

三、常用的药敏试验方法
兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。
由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在兽医临床已较少应用。以下简单介绍纸片法。
1、药敏纸片的制作
纸片法中使用的药敏纸片目前市场上已有较多厂家的产品销售。但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：
取质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。同时在记录药物名称，于37℃温箱过夜。在温箱或烘箱中的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。青霉素、金霉素宜在低温下真空干燥。干燥后即密封。切勿受潮，置阴暗干燥处或家用冰箱中保存，有效期4-6个月。

2、药液的制备
自制药敏纸片时还需自行配制抗菌药液。抗菌药的稀释剂通常用蒸馏水。一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度，按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：1g本品加5000ml蒸馏水。此溶液液即为用于做药敏试验的药液。

3、试验操作方法
在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。然后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5－6片。记住每种药敏纸片的名称。贴完纸片的平皿15分钟后再置于37℃温箱中培养16－24小时，观察记录结果。以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。
药敏试验结果判定标准
抑菌圈直径（毫米）敏感性
＞20极敏感
15-20高敏感
10-14中敏感
＜10低敏感
0不敏感
实践证明，利用自制药敏纸片进行药敏试验，可以灵活选药，与某病菌相关的药物均可随时制作药敏纸片用于治疗。可在本场药品范围内或本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物。还可在短时间内选择最佳药品和最佳剂量，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少浪费。
四、根据药敏试验选药原则
完成药敏试验后，应根据结果选择敏感性较高，同时价廉、易得、安全的药物进行治疗，以减少耐药菌株，同时还应注意以下原则：
1、在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。
2、药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70－80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。如发现疗效不显着应及时换药。
3、药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。
4、窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。
5、避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。

四、影响药敏试验结果的因素
在以纸片法进行药敏试验时，以下几方面因素可影响试验的结果：
1、培养基：首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。其次，倾注平板时，厚度应合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
2、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4、培养时间：一般细菌培养温度和时间为37℃ 12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。

五、药敏试验存在的问题
当前进行药敏试验仍然存在一些问题，主要包括以下几方面：
1、方法学不统一，没有标准化。
2、市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。所以还是建议按要求自制药敏纸片。

兽医临床中的药敏试验

兽医临床中的药敏试验
目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。
一、什么是药敏试验？
抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility test，AST），简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。

二、药敏试验的意义
1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。是一种既经济又有效的方法。
2、可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。
3、为临床用药提供参考依据。因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。根据已进行的大量药敏试验结果，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株。这是一个非常危险的信号。所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。

三、常用的药敏试验方法
兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。
由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在兽医临床已较少应用。以下简单介绍纸片法。

1、药敏纸片的制作
纸片法中使用的药敏纸片目前市场上已有较多厂家的产品销售。但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：
取质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。同时在记录药物名称，于37℃温箱过夜。在温箱或烘箱中的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。青霉素、金霉素宜在低温下真空干燥。干燥后即密封。切勿受潮，置阴暗干燥处或家用冰箱中保存，有效期4-6个月。

2、药液的制备
自制药敏纸片时还需自行配制抗菌药液。抗菌药的稀释剂通常用蒸馏水。一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度，按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：1g本品加5000ml蒸馏水。此溶液液即为用于做药敏试验的药液。

3、试验操作方法
在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。然后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5－6片。记住每种药敏纸片的名称。贴完纸片的平皿15分钟后再置于37℃温箱中培养16－24小时，观察记录结果。以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。
药敏试验结果判定标准
抑菌圈直径（毫米）敏感性
＞20极敏感
15-20高敏感
10-14中敏感
＜10低敏感
0不敏感
实践证明，利用自制药敏纸片进行药敏试验，可以灵活选药，与某病菌相关的药物均可随时制作药敏纸片用于治疗。可在本场药品范围内或本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物。还可在短时间内选择最佳药品和最佳剂量，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少浪费。

四、根据药敏试验选药原则
完成药敏试验后，应根据结果选择敏感性较高，同时价廉、易得、安全的药物进行治疗，以减少耐药菌株，同时还应注意以下原则：
1、在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。
2、药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70－80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。如发现疗效不显着应及时换药。
3、药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。
4、窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。
5、避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。

四、影响药敏试验结果的因素
在以纸片法进行药敏试验时，以下几方面因素可影响试验的结果：
1、培养基：首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。其次，倾注平板时，厚度应合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
2、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4、培养时间：一般细菌培养温度和时间为37℃ 12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。

五、药敏试验存在的问题
当前进行药敏试验仍然存在一些问题，主要包括以下几方面：
1、方法学不统一，没有标准化。
2、市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。所以还是建议按要求自制药敏纸片。
3、因需要先进行细菌的分离培养，所以药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。但根据有关报道，也可进行简易的药敏试验，方法如下：无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1：5加生理盐水研磨制成悬液，静置5分钟，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5分钟后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小。
4、对于部分营养需求较高的细菌或微生物，如链球菌和支原体，临床上较难培养，限制了药敏试验的应用。
5、部分养殖场或基层兽医站缺乏做细菌分离培养和药敏试验的意识。绝大多数养殖者或技术人员是在没有明确微生物学诊断的情况下使用抗菌药物，养殖场规模越小，细菌培养和药敏试验做的越少，有的养殖场轮翻使用多种抗菌药物而不做细菌培养和药敏试验，致使疗效不佳，治疗时机延误和药品的浪费。一些病例用药前不做药敏试验，而是在大量使用多种抗菌药物疗效不明显时才想起做细菌培养和药敏试验，而此时细菌已对多种抗菌药产生耐药性。

② Etest法是什么

药敏纸片法用来测试MIC的方法

③ 简述K-B纸片琼脂扩散法原理及影晌因素。

K-B纸片琼脂扩散法原理:将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制,从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系,即抑菌圈愈大,MIC愈小。 影响纸片法药敏试验结果的因素有:1培养基的质量,如pH、深度、硬度和表面湿度等。对每批商品化或自配MH琼脂必须用标准质控菌株进行检测,合格后方能使用;2药敏纸片的质量,含药量和保存方式;3接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一,取决于麦氏比浊标准的配制,正确使用和保存;4试验操作质量;5孵育条件,温度和时间;6抑菌圈测量工具的精度;7质控标准菌株本身的药敏特性是否合格,有无变异。

④ 生化鉴定of怎么配制

不同细菌所具有的酶系统各不相同，对营养物质的利用能力各异，它们在代谢过程中所产生的代谢产物也不同，通常用化学或生物化学方法检测细菌的代谢产物，有助于细菌属、种的鉴定。这种利用生化方法来鉴别细菌的实验，称之为细菌生化反应，是鉴定细菌的重要方法之一。通过本次实验，要求熟悉常用生化实验原理，掌握其方法、结果判定及其意义。
1 单糖发酵实验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差别，有的能利用有的不能利用，能利用者，又可分为产气或不产气。可用指示剂及各种发酵管进行检测。
本实验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别。每次生化实验，常需同时接种多管不同生化反应管。根据生化反应管的不同加不同指示剂，常用的指示剂有酚红、溴甲酚紫，溴百里酚蓝等。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌、伤寒沙门菌
2．培养基：葡萄糖、乳糖发酵管（内置倒管）或半固体培养基
【方法】
无菌操作，用接种环将上述两种细菌接种葡萄糖及乳糖发酵管各一支；若为液体培养基，用接种环沾取少许细菌接种，置37℃培养18～24小时后观察结果。观察培养基颜色有无改变，小倒管中有无气泡；若为半固体培养基，则用接种针接种，观察穿刺线、管壁及管底有无微小气泡，细菌有无动力，有动力时，细菌在培养基中沿穿刺线呈毛刷样生长。
【结果】
观察结果时，首先确定有无细菌生长，有细菌生长时，培养基常呈混浊状。然后确定细菌对糖类分解情况，如发酵糖类产酸，则培养基中酸碱指示剂变成其酸性颜色，可用“+”号表示。如发酵糖类产酸又产气，此时培养基除变色外，在倒置小管中有气泡出现，可用“ ”表示。如细菌不分解该糖时，则指示剂不变颜色，倒置小管无气泡，以“－”表示之。注意实验时仔细观察两种细菌对两种糖的发酵情况，并记录好结果。
2 IMViC实验
通常将吲哚实验（I）、甲基红实验（M）、VP（Vi）实验、枸橼酸盐利用实验（C）称为IMViC实验，主要用于鉴别肠杆菌科各个菌属，特别是大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。
一、靛基质实验
某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚等产物。吲哚可用显色反应检测，吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛结合，生成红色化合物玫瑰吲哚。
实验证明靛基质试剂可与17种不同的靛基质化合物作用而产生阳性反应，实验前若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，只有靛基质或5-甲基靛基质在溶液中呈现红色，因而结果更为可靠。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，产气肠杆菌斜面培养物
2．培养基：蛋白胨水培养基
3．试剂：吲哚试剂
【方法】
将上述两种细菌分别接种于蛋白胨水培养基中，置37℃培养18～24小时后，沿管壁缓慢加入吲哚试剂0.5 mL（2～3滴），使试剂浮于培养物表面，形成两层，立即观察结果。
【结果】
两液面交界处呈现红色时为阳性，无变化者为阴性。
二、甲基红实验
有些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸继续分解生成乳酸、甲酸、乙酸等产物，由于产生大量有机酸，培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂时呈现红色。而有些的细菌如产气肠杆菌，由于分解葡萄糖时产酸量少，加上产生的酸进一步转化为其它物质如醇、酮、醛等，培养基的pH维持在5.4以上，加入甲基红指示剂时呈黄色。甲基红为酸性指示剂，pH变色范围为4.4～6.0。故在pH 5.0以下，随酸度增加而显红色，在pH 5.0以上，则随碱度增加而呈黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不明显，此时应延长培养时间，重复一次实验。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，产气肠杆菌斜面培养物
2．培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基
3．试剂：甲基红试剂（pH变色范围为4.4～6.0）
【方法】
将两种细菌分别接种于上述培养基中，置37℃恒温箱中培养18～24小时后，各取2 mL培养液，加入甲基红试剂2滴，轻摇后观察。
【结果】
出现红色反应为甲基红实验阳性，黄色为甲基红实验阴性。
三、VP（Voges－Proskauer）实验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中O2氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基化合物反应生成红色化合物，称V－P（＋）反应。本实验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌鉴别时，普通培养基中的磷酸盐因阻碍乙酰甲基甲醇的产生，操作时应省去或以NaCl代替。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，产气肠杆菌斜面培养物
2．培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基
3．试剂：VP试剂（6% α－萘酚乙醇溶液，40% 氢氧化钾溶液）
【方法】
将细菌分别接种于上述培养基中，置37℃恒温箱中培养24～48小时后，分别取2 mL培养物，加入6%α－萘酚乙醇溶液1 mL，再加入40%氢氧化钾溶液0.4 mL，充分振荡后，室温下静置5～30分钟观察结果。
【结果】
呈红色反应为阳性，如无红色出现，且置37℃4小时仍无红色反应者为阴性。
本实验常与甲基红实验一起使用。本实验阳性，甲基红实验阴性，反之亦然。
四、枸橼酸盐（Citrate）利用实验
枸橼酸盐培养基中不含任何糖类，枸橼酸盐为唯一碳源，磷酸二氢铵为唯一氮源。如果细菌能利用铵盐作为唯一氮源，并能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，则可在此培养基上生长，分解枸橼酸钠，生成碳酸钠，使培养基变碱，此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，产气肠杆菌斜面培养物
2．培养基：枸橼酸盐斜面培养基
【方法】
将细菌分别接种于上述培养基斜面上，于37℃培养1～4天，每日观察结果。
【结果】
培养基斜面上有细菌生长，而且培养基由绿色变深蓝色者为阳性；无细菌生长，培养基颜色不变，保持绿色为阴性。
观察并记录以上实验结果。
3 硫化氢实验
有的细菌能分解培养基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。该实验在肠杆菌科的细菌生化鉴别中有重要作用。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌，普通变形杆菌。
2．培养基：醋酸铅或克氏铁琼脂培养基。
【方法】
将细菌分别接种于上述培养基中，置37℃恒温培养箱中培养1～2天后，观察并记录结果。
【结果】
醋酸铅培养基出现黑色沉淀为阳性。不变色为阴性。克氏铁琼脂在底层和斜面交界处出现黑色沉淀者为阳性，不变色为阴性。普通变形杆菌：＋，大肠埃希菌：－。
4 脲酶实验
有些细菌能产生脲酶，分解尿素产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，使酚红呈现粉红色。脲酶不是诱导酶，因而不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其最适pH为7.0。主要用于肠杆科细菌的鉴定。
【材料】
1．菌种：大肠埃希菌、普通变形杆菌。
2．培养基：尿素培养基
【方法】
将细菌分别接种于尿素培养基中，置37℃恒温培养箱中培养18～24小时后，观察并记录结果。
【结果】
培养基变红色者为阳性，不变色者为阴性。
5 微生物自动分析
常规细菌学检查，需首先将标本进行分离纯化，取纯化后的细菌进行一系列的鉴定，包括形态学检查、生化反应、血清学反应等，由于手续烦琐，分析周期长，且由于是手工操作，造成质量难已保证，虽然后来出现了各种商品化的检测试剂及培养基，但仍不能从根本上解决上述问题。20世纪70年代后，微生物学家与工程技术人员密切合作，发明制造了许多快速的细胞培养分析系统，使原来缓慢烦琐的手工操作变成了简单的自动化操作，缩短了工作时间，提高了工作效率及培养阳性率。
一、微生物自动分析的原理
微生物鉴定的自动化系统大致分为两大类：一类是自动血液培养检测和分析系统，即检测血标本中是否有细胞存在；另一类是自动微生物鉴定及药敏系统，即将分离的细菌进行生化实验加以鉴定，并进行抗生素的敏感性实验。
（一）自动血培养检测及分析系统的工作原理
自动血培养仪的工作原理分为以下三种：
1． 检测培养基导电性质和电压的变化进行微生物的分析
培养基中因含不同电解质而具有一定的导电性，微生物在生长代谢过程中可产生质子、电子和各种带电荷的原子团［如在液体培养基中二氧化碳（CO2）转变成CO3-］，通过电极检测培养基的导电性或电压改变即可判断有无细菌的生长。
2． 应用测压原理进行微生物的分析鉴定
很多需氧菌在胰酶消化大豆肉汤中生长时，由于需消耗培养瓶中的氧气，故首先表现为吸收气体，而厌氧细菌生长时，最初无吸收气体的现象，仅表现为产生气体［主要是二氧化碳（CO2）］，因此利用培养瓶内气体压力的改变即可检测微生物的生长情况。
3． 利用光电原理监测的细菌检测和分析系统
微生物在代谢过程中必然会产生终代谢产物二氧化碳（CO2），引起培养基pH下降，氧化还原电位的改变，利用光电比色检测血培养瓶中某些代谢产物量的改变即可判断有无微生物的生长。
（二）细菌自动鉴定及药敏系统
1．工作原理
（1） 鉴定原理
采用数码鉴定原理。如VITEK－AMS中每个用于鉴定的测试卡内有30项生化反应，每3项生化反应为一组，第1项生化反应阳性值为“4”，第二项反应阳性值为“2”，第三项反应阳性值为“1”，各项反应阴性记为“0”。将每组3项反应的阴、阳性结果转换成数值并相加，如3项生化反应全部为阳性，其组值为“7”。第1、3项生化反应为阳性，组值为“5”，依此类推。将各组反应的组值相加，30项生化反应可得到一组10位数的生物数码，在鉴定时有时还需外加补充实验，共可获得11位生物数码。而MicroScan的WalkAway系列则采用8进制计算法分别将28个生化反应转换成8位生物数码。计算机系统自动将这些生物数码与碥码数据库进行对比，获得相似鉴定值。
微生物自动鉴定系统的鉴定板包括常规革兰阳（阴）性板和快速荧光革兰阳（阴）性板两种，其检测原理各不相同，常规革兰阳（阴）性板对各项生化反应结果（阴性或阳性）的判定是根据比色法的原理，将菌种接种到鉴定板后进行培养，由于细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又具有不同的生化特性，因此各生化反应的颜色变化各不相同。仪器自动定时测定每一生化反应孔的透光度，当生长对照孔的透光度达到终点阈值时，指示已完成反应。快速荧光革兰阳（阴）性板则根据荧光法的鉴定原理，荧光物质均匀地混在培养基中，将菌种接种到鉴定板后，通过检测荧光底物的水解、底物被利用后的pH变化、特殊代谢产物的生成和某些代谢产物的生成率来进行菌种的鉴定。
（2） 药物敏感实验的测试原理
药敏测试板的药物敏感性实验的实质是微型化的肉汤稀释实验，采用回归法测定最低抑菌浓度（MIC）。每一种药物一般选用3种不同药物浓度，仪器每隔一定时间自动测定小孔中细菌生长状况，得出待检菌在各药物浓度的生长斜率，经回归分析得到MIC值，并根据NCCLS标准得到相应敏感度。
药敏测试板也分为常规测试板和快速荧光测试板两种。常规测试板的检测原理为比浊法，即由于细菌生长情况不同而引起菌液浊度的变化，通过检测浊度来确定MIC值；快速荧光测试板的检测原理为荧光法，通过检测荧光的增加间接地测定MIC值。
二、大肠杆菌的自动分析仪分析
【材料】
1．MicroScan主机：MicroScan微生物自动分析系统主要由主机，软件系统，各种鉴定板（革兰阳性板、革兰阴性板，酵母菌板、厌氧菌板及HNID板），各种药敏实验板，专用取菌针， RENOK系统（用于将细菌悬液加入各种反应板中）等。
2．大肠杆菌肉汤培养物
3．革兰阴性菌鉴定板
4．革兰阴性药敏板
5．专用取菌针
【方法】
1． 从包装中取出反应板，要注意包装内如没有干燥剂或板的外包装有破损均不可使用。
2． 氧化酶实验：在接种板前，先进行氧化酶实验，把结果记录在对应的工作单上。
3． 细菌悬液的配制：使用一校准过的专用取菌针沾取3～5个菌落，用环状的盖帽将针边缘上多余的细菌刮掉，将取菌针插入专用的prompt接种水瓶中，彻底混匀再接种。
4． 应用专用的RENOK系统在板孔中接种细菌悬液，每孔105～115 μL。
5． 滴加无菌矿物油：在GLU、URE、H2S、LYS、ARG、ORN和DCB孔中加入三滴矿物油。
6． 加密封条：对氧化酶阳性细菌，在CIT、MAL、ONPG、TAR、ACE、CET、OF/G和DCB孔上放置密封条，在DCB孔上密封条留一1/4英寸的定位孔。
7． 培养：将板置35℃非CO2培养箱中培育16小时左右。
8． 读板：将板置MicroScan测试设备中读板，计算机自动打印结果。
【注意事项】
1． 如果干板是储存于冰箱中，则要立即从锡纸包装中取出干板，并让其平衡至室温后再水化，然后再加一干净的盖，已打开包装的板应在同一天内使用。
2． 接种时，同时将被试悬液划线接种到一血平板上，16～20小时培养后，如果平板上出现两种或以上菌落形态，则必须重新测定。
3． 加矿物油时，孔中的培养基必须被矿物油完全封盖，但不能使矿物油流出孔外。
4． 孵育时，为防止水分蒸发，在反应板上放置一块干净的盖板。
5． 读板前，用不含棉纤维的清洁纸将板底部抹净。
6． 生长质控孔（G孔）无菌生长时不要读板、控制孔（C孔）出现细菌生长或G孔无菌生长时不要读取药敏结果。

⑤ 棋盘法是什么

棋盘法是一种概率的计算方法，是一种最简单最直接计算杂交后代基因型和表型概率分布的方法。

棋盘法（Punnett square）的优点是准确可靠，缺点太烦琐，不适合多对基因的组合，如四对基因，配子类型有32种，将有1024种组合81种基因型，画起来太不方便，且容易出错，所以人们采用了比棋盘法要更为简便的分析法来推测。

棋盘稀释法

棋盘稀释法包括微量棋盘稀释法、试管棋盘稀释法和琼脂棋盘稀释法三种，其中微量棋盘稀释法为最常用的联合药敏方法之一。它常使用96孔无菌微孔板，每种抗菌药物最高从2倍MIC浓度开始用灭菌MH肉汤倍比稀释，一般取6～8个稀释度左右，

各取50μl分别排列在平板的行与列上，然后在无菌微孔板中加入100μl菌液，使最终接种量为5×105CFU/ml，过夜培养，无细菌生长的最低药物浓度为MIC。通过计算部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration，FIC)判断相互作用。

⑥ 如何测麦克风灵敏度

麦克风灵敏度一般在94 dB的声压级（SPL）（或者1帕（Pa）压力）下，用1 kHz正弦波进行测量。
麦克风在该输入激励下的模拟或数字输出信号幅度即是衡量麦克风灵敏度(该基准点只是麦克风的特性之一，并不代表麦克风性能的全部)。