抗生素检测方法验证

1. 检测牛奶抗生素的方法能用于检测蜂蜜吗

检测牛奶抗生素的方法能用于检测蜂蜜的。
牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法 随着奶牛饲养业的发展，抗生素在预防和治疗奶牛疾病方面得到广泛的应用。生鲜牛奶中抗生素的来源主要是：第一，治疗泌乳期病牛时使用的抗生素会从奶牛体内移行到乳腺残留进入牛奶中，资料表明治疗后的奶牛，其挤出的牛奶5天内都有抗生素残留；其二，为了预防奶牛疾病并提高产量，在奶牛饲料中添加抗生素也会造成牛奶中抗生素的残留；第三，由于牧场管理不善，挤奶、储奶没有严格的卫生制度和配套的设施，人为添加或造成牛奶抗生素的污染。 牛奶中含有抗生素，不仅对人的健康造成很大的危害，而且对乳品加工企业带来经济损失（因无法生成酸奶和奶酪）。因此必须严格控制牛奶中抗生素残留，除了要做好科学饲养、精心管理；正确挤奶和预防疾病外，还要规范抗生素的使用，按国标中有关规定，用药后的奶牛5天后所产的牛奶才可作为原料乳，并且要检测其残留。世界粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）、欧盟（EC）及美国的食品和药品管理局（FDA）等对食品中抗生素最大残留量都有明确的规定，我国也有鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27—94）。 目前，鲜奶中抗生素残留的检测方法大致分为三类：生物测定法（微生物测定法、放射受体测定法）、免疫法（放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法）、理化分析法（波谱法、色谱及联用技术）。下面介绍几种常用的牛奶中抗生素残留检测方法。 TTC法 TTC法是我国鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27—94）的检测法，属生物检测法。其测定原理基于抗生素对微生物的抑制作用。如果牛奶中含有抗生素，则加入菌种（嗜热链球菌）经培育2.5~3小时后,加入TTC指示剂(三苯基四氮唑)不发生还原反应,所以样品呈无色状态;如果牛奶中不含抗生素,则样品呈红色.这样实验后样品颜色不变的为阳性,样品染成红色的为阴性。 TTC法的具体操作步骤: 1.菌液制备:将单菌种(嗜热链球菌)以脱脂乳为培养基,在36±1℃培养箱中培养15小时后,再以脱脂乳以至于1:1稀释待用; 2.取待检样液9mL,在80℃水浴加热5分钟后冷却到37℃以下,加活菌液1mL,在36℃±1℃水浴2小时,加入4%的TTC指示剂0.3mL, 36℃±1℃水浴培养30分钟; 3.若样液颜色不变为阳性,呈红色为阴性;若阳性的样液,再置于水浴中培养30分钟,不显色的为阳性,呈红色为阴性. TTC法测定各种抗生素的灵敏度为:青霉素:4ppb,链霉素:500ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:5000ppb.它具有费用低,易开展的优点;缺点是耗时长，要求操作人员需有一定专业知识且实验过程中菌液的制备、水浴过程控制都要求严格遵守操作规程，否则易出现假阳性，以致出现检验结果的不稳定性。 Delvotest? sp法（戴尔沃检测法） 该法最早在香港传到广东的，其使用是基于20世纪80年代初香港要求广东出口的生奶必须“无抗”且要求采用Delvotest法检测。该方法也是生物测定法，其试剂是由荷兰DSM公司生产并由AOAC认证。原理是利用微生物—嗜热芽胞菌在64℃条件下培养2.5～3小时后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若牛奶样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素, 嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸,指示剂将不变色. Delvotest? sp 法的操作步骤: 1.以无菌操作将一片营养药片夹放入小试管内; 2.用微量移液管将0.1mL牛奶样品注入小试管内; 3.把小试管放入已预热至64℃的水浴箱或恒温器中培养; 4).定时3小时取出观察颜色变化.如果底部2/3的固体介质是黄色,则为阴性, 如果底部2/3的固体介质是紫色,则为阳性. Delvotest? sp 法具有广谱性,可检测到?-内酰胺类抗生素在内的更多抗生素,如磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素等，其中对青霉素和磺胺类抗生素特别灵敏. 其灵敏度为：青霉素:3ppb,链霉素:300ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便，严格实用，容易判断，结果可靠，费用适中等优点；但也易出现假阳性，实验证明：当牛奶样品中添加微生物防腐剂（如乳酸链球菌素—Nisn）或样品中有足够的洗涤剂残留时，便可影响嗜热芽胞菌生长而使实验为阳性。 Snap?法 该方法是酶联免疫法，由美国IDEXX公司生产其检测分析仪及其试剂盒，均获得AOAC认证，它利用了竟争酶联免疫技术。其基本原理是用特异性抗体将固相载体激活，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原在45℃±5℃共同保温，使样品内的抗生素与内置抗生素标志物竟争与固定的抗体结合，然后进行洗涤和显色，内置抗生素标志物与固定的抗体结合形成的复合体，通过酶的作用分解可形成有色物质，通过测定色度并与参照物对照，就可以确定结果是阳性或阴性。 Snap?法操作步骤： 1.加入乳样于样品管中,摇匀,加热样品和检测板5分钟; 2.加入乳样于样品孔中,当激活圆环开始退却时,按Snap键; 3.反应4分钟,由Snap?读数仪读取并打印结果.检测读数小于1.05时判为阴性,大于1.05时判为阳性. Snap?法是一种将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法,其敏感性和特异性好,检测的灵敏度以普遍使用的?-内酰胺类计：青霉素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨苄西林:10ppb,头孢西林:8ppb.其他抗生素如四环素等的检测,则需购买相应的试剂来检测. Snap?法检测结果快速准确, 9分钟内即可检测出牛奶中?-内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素的残留含量，且有半定量的读数，可监控牧场用药的情况；检测仪器稳定性良好，结果重现性高，整个检测过程简单方便；但需购置专用仪器和试剂，成本较高。 高效液相色谱检测法 它是一种理化检测方法,是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应来测定其含量.检测的过程采用了气相色谱理论,通过高压液相和高灵敏度的检测器,分离速度快、效率高和操作自动化。一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤，能检测抗生素的具体含量，敏感性较高，但检测程序复杂，费用较高，需购买色谱仪等检测设备，不适合小型检验室。 传统的抗生素检测方法不少,有的操作烦琐,有的实验条件要求高,有的检验时间太长;这些不仅会给乳制品生产企业造成经济上和时间上的损失,而且检测结果常常会被原辅材料和人为操作等因素所影响.鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题,乳品企业及牧场应重视和加强检测工作,应用一些简单、快速和准确性高的方法来监控产品的质量，保证消费者的健康。 纳米胶体金层析法 该方法是基于竞争法胶体金免疫层析技术，将检测液加入试纸卡上的样品孔，检测液中的抗生素与金标垫上的金标抗体结合形成复合物，若抗生素在检测液中浓度低于100ng/mL，未结合的金标抗体流到T区时，被固定在膜上的抗生素BSA偶联物结合，逐渐凝集成一条可见的T线；若抗生素浓度高于100ng/mL，金标抗体全部形成复合物，不会再与T线处抗生素BSA偶联物结合形成可见T线。未固定的复合物流过T区被C区的二抗捕获并形成可见的C线。C线出现则表明免疫层析发生，即试纸有效. http://www.quicking.cn/chinese/content.asp?MoleType=3&ChannelID=3&id=174 胶体金法操作步骤： 1．将采集的牛奶样品进行编号，置于常温（20-30℃）室内。（低温牛奶流动性差，不适合进行试纸层析测试） 2．摇匀牛奶，用吸管取1mL加入到离心管中，7000rpm离心3-4分钟至分离出脂肪层。脂肪层下5mm处液体（脱脂牛奶）即为待测液。 3．取出试纸条，用吸管吸取3滴待测液滴于加样孔中， 4．5分钟后判断结果，10分钟后的结果无效。 http://www.quicking.cn/chinese/content.asp?MoleType=3&ChannelID=3&id=156 结果解释 阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。 阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。 无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸均判为无效。 保存和稳定性 4-30℃阴凉干燥处保存，不可冷冻，避免阳光直晒，生产日期起18个月内有效。 纳米胶体金层析法适用于样品的初筛，检测时间短，出结果速度快，且能在常温下保存18个月之久，操作简单，无需任何专业的技术，没有检测环境的需求不管是奶农还是奶站工作人员还是专业的检测人员，都可以方便使用。

2. 微生物检验常见问题解答

微生物检验常见问题解答

你知道什么是微生物检验吗?你对微生物检验常见问题了解吗?下面是我为大家带来的微生物检验常见问题解答的知识，欢迎阅读。

一、方法验证

1.做过验证的样品微生物检验方法是否都需要按照新的方法进行重新验证?

答：对于微生物限度检查的产品而言，由于培养时间调整，应重新进行验证。对于无菌检查的产品而言，如果方法未作实质性调整，可以不必重新验证。个别产品在各论中收载了新的无菌检查方法，对这些品种，应对收载方法的适用性进行验证。

2. 以前做过无菌验证的品种是否需要重新按照新的标准再验证?

答：参见问题1。

3. “新增抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜” 比如注射用克林霉素磷酸酯属于抗生素，是否需要重新选取滤膜再验证?

答：目前采用的方法如果经验证表明可行，则可以继续使用该方法。

4. 微生物方法学验证时，培养时间是否跟样品日常检验所培养时间一致?

答：应该一致。

5. 微生物限度验证时，如果一个方法只有金葡回收率达不到要求，该方法时是否可以用来做细菌霉菌的检测方法?

答：按药典的规定，一个计数方法通过验证，是指所有试验菌的回收率均达到要求。如果采用各种方法以及方法的组合仍无法使金葡回收率达标，则可以采用使金葡回收率最高的方法作为计数方法。

6. 薄膜过滤的冲洗量不能超过1000ml，我公司的喹诺酮类产品原来的方法是每张膜冲洗量为1500和2000ml，请问有没有合适的方法将冲洗量降至1000，各菌的回收率仍能符合规定?

答：有几种办法可以降低冲洗剂的用量：1)降低接触滤膜的供试品的浓度;2)改进冲洗的方式，如少量多次地冲洗、降低蠕动泵的转速等;3)添加中和剂，如高价金属离子。

7. 微生物限度检查法规定，技术方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品检验。请问，上述方法是指仅通过一种方法还是一定要通过几种方法联用的?

答：应该要把可能采用的所有方法包括方法联用都进行验证。

8. 供试品不溶于稀释剂，同时又有抑菌性，限度检查时应如何消除抑菌性?

答：采用低速离心的方式，尽可能把供试品去除干净，取离心后的上层液，进行薄膜过滤。

9. 不溶于水的固体产品，加表面活性剂后，如何操作才能在方法验证中得到较好的回收率?

答：同问题8。

10. 有些品种2010年药典与2005年比较检验方法变了，是否需要验证或确认?

答：同问题1。

二、菌种管理

1. 浓菌液的有效期该如何确定?

答：药典没有规定。可以通过实验确定有效期。例如，在不同的时间点测定浓菌液的浓度，从而判断其有效期。

2. 药典要求菌液在制备后2小时内使用，若保存在2-8℃的菌悬液可在在24小时内使用，那我们在做验证或阳性对照是要加一定量的菌就没有时间进行平板计数了，该如何确保所加菌量准确?

答：药典对稀释菌液的使用期限作出规定，并不会影响操作过程中稀释菌液的加入。即便不规定，也无法在准确知道菌液浓度的情况下加入试验菌。菌液稀释的实验操作和加入菌液的实验操作应该是在同一次实验中完成的，要使加入的菌量符合药典的规定，可以从浓菌液的制备方法、菌液稀释的方法等方面进行规范，也可以引入浊度比较的方法。

3. 菌悬液能否在倒平板之前确定菌含量?

答：活菌含量是无法确定的。总菌量可以通过比浊的方式确定。

4. 具体从哪些方面进行菌种菌株的特性和纯度确认?如何操作?

答：基层的微生物实验室进行菌种纯度确认可以考虑以下一些方面：1)形态学鉴定，包括菌落形态和染色形态;2)生化鉴定，可以考虑使用API鉴定系统。

5. 黑曲霉冻干菌种如何转种，传代?

答：与其他菌种一样，所不同的是使用的培养基应改为改良马丁琼脂培养基。

6. 干粉状的是否可做第0代使用?

答：只要是菌种保藏机构提供的冻干保藏的菌种，可以确定为第0代。

7. 菌种每次传代都要做纯度、特性等的确认吗?

答：从外部购入的菌种，在进入本实验室的菌种保藏体系时，需要进行纯度和特性的确认。以后的每次传代，可以通过显色培养基做简单的确认即可。

8. 如采用低温保存菌种，需购买哪些设备?能够到省所进行实际操作培训?

答：低温冰箱，应能够提供-70℃的低温。可以到省所来培训。

9. 做方法验证时，工作用菌种能否同时操作，如何防止交叉污染?

答：可以同时操作。避免交叉污染的关键是无菌操作技术。

10. 是否等菌悬液的含菌数出结果后再做适用性等检查?

答：没有必要。可参见问题2。

11. 菌液制备中菌液是否都要验证储存期?

答：稀释菌液可参考药典规定。如要保存浓菌液，则需要验证有效期。

12. 菌种CMCC是否可以用ATCC替代，从省所或中检所购买的菌种是否每次都可以出具规范的COA?

答：中国药典使用CMCC的菌种，并没有规定可以使用其他等效的菌种。省所提供的菌种严格讲属于标准贮备菌种，无法提供ATCC这样的COA。CMCC至今也无法提供这类证明。

13. 铜绿假单胞如何保藏?答：可以使用低温冷冻保存的方法。14. 工作用菌液是否属于亚培养或传代一次?

答：工作用菌液应属于一次传代。

三、微生物限度

1. 包装材料的大肠埃希菌检查?

答：根据包装材料的不同，大肠埃希菌的检查方法大致有两种，一种是将浸提液合并后，取一部分，接种胆盐乳糖培养基进行检查;另一种是将浸提液合并后，薄膜过滤，然后按规定的方法检验。

2. 抗真菌药品的微生物限度检查法

答：这类产品的霉菌和酵母菌计数方法需要进行调整，可以根据产品剂型的不同，选择薄膜过滤法或培养基稀释法等方法。

3. 为什么在日常样品检测中还需要做阳性对照(国外不需要)?

答：为了确保每一次检测对可能存在的微生物都是有效的`。

4. 对于同一个品种，药典为什么不规定统一的检测方法?

答：本版药典进行过这样的尝试，也有某些品种已经收载了统一的检测方法，如注射用头孢类抗生素的无菌检查。之所以没有大量收载，主要是由于检测方法还没有经过必要的复核。将微生物检验的统一方法收载在品种的各论项下，始终是努力的方向。

5. 梭菌检查中需置厌氧条件下培养48小时，是否指在厌氧培养箱中?

答：需要在厌氧培养装置中进行培养，未必一定是厌氧培养箱。

6. 控制菌检查方法验证时，采用多种方法均未检出控制菌，如何处理?

答：在确保所使用的各种方法都没有错误的情况下，如果仍无法使试验菌生长，则应该采用薄膜过滤法进行检查。理由是该方法能够最大程度地去除产品的抑菌作用。

7.常规的监督抽样检品(包括原料)在进行微生物限度检查时，是否一定要进行活螨检查并在原始记录与报告书中体现?

答：需要进行检查。可以在原始记录中体现，报告书上可以不出现，除非当发现有活螨检出。

8. 药包材微生物限度检查规定了合格质量水平，通常产量下取样8个，要求8个瓶子均符合规定，如何进行?

答：每个瓶子分别进行实验。

9. 大肠埃希菌具体操作规程?

答：参见中国药品检验标准操作规程。

10. 动物组织及动物类原药材的提取物入药，是否需要检沙门菌?

答：需要进行沙门菌检查。

11. 关于中国药典菌落计数结果的判断还存在疑义，望能举例说明。

答：不清楚所指的存在疑义是指哪方面。2010年版对结果报告进行了较大篇幅的修订，目前的规定应该比05版更为清晰、明确。

12. 需做沙门菌检验样品量的确定?

答：10g(ml)用于样品计数检验和其他控制菌检查，10g(ml)用于沙门菌检查，10g(ml)用于沙门菌检查的阳性对照。需要进行沙门菌检查的样品，检验用量应为30g(ml)。

13. 日常的实验室装备能否达到梭菌无氧的培养要求?

答：完全可以。可以采用厌氧培养盒(罐)。

14. 如果一个产品有两个规格，是否可以取其中之一做阳性对照?

答：每个规格均需进行阳性对照。

15. 细菌数为100g/g的，样品稀释级只做1:10,1:100的倍数就可以了吗?

答：可以。

16. 培养时间3天，5天，可理解为72小时，120小时吗?

答：可以。这样更为严谨。

17.中国药品检验标准操作规范“已做验证试验的供试品，在检查时刻不必再做阳性对照”如何理解?

答：该标准操作规范中在无菌检查法中规定“供试品无菌检查应进行阳性对照试验”，表明不论是否进行了方法验证，在产品的每一次检验过程中，还必须进行阳性对照。在控制菌检查的大肠埃希菌项下，指出“已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再作阳性对照”。该规定仅适用方法验证与供试品检查同时开展的情况。2005年版药典和2010年版药典在控制菌检查中均对阳性对照试验有明确规定，“进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。”产品检验中应以药典规定为准。

18. 无菌检查和微生物限度检查中，产品中规定的溶解液是否可以换成其他的溶液?

答：可以。

19. 制剂通则中，没有微生物检查项目的，是否可不进行微生物项目检测?

答：可以。主要是二部制剂通则中口服片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。

20. 在细菌、霉菌和酵母菌计数中，适用性检查细菌是培养48小时，霉菌和酵母菌是培养72小时，供试品检查中细菌是培养3天，霉菌和酵母菌是培养5天，那方法验证中应参照哪个时间进行培养。

答：应按照供试品检验时的条件，即细菌3天，霉菌和酵母菌5天。

21. 测定纯化水微生物限度时，每张滤膜过滤量是多少合适?需要先稀释吗?过滤完后需不需要冲洗?假如我取10ml纯化水通过双杯体封闭式薄膜过滤器过滤，每张滤膜上的计数是以5ml为单位还是10ml为单位?

答：过滤量应以培养后出现的微生物数不超过100cfu/膜为标准。一般可不稀释。不需要冲洗。每张滤膜的过滤量为5ml。

22. 2010药典中关于纯化水的微生物限度是：细菌、霉菌及酵母菌总数每1ml不得过100个。这句话的意思是细菌总数每1ml不得过100个，霉菌及酵母菌总数不得过100个，还是细菌+霉菌+酵母菌总数每1ml不得过100个。如果是三者总数的话，那细菌总数限度是多少?霉菌及酵母菌总数限度又是多少?

答：是总数不得过100个。没有必要考虑各自的限度值。

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3. 抗生素检测的发展趋势

国内外使用最广泛的还是液相色谱法及其联用技术。高效液相色谱具有灵敏度高、精确度高、分析效力高以及检测限低、特异性强的优点，同时也存在仪器昂贵、操作繁琐、需要专业的分析操作人员、样品处理复杂、成本高的缺点。所以，该种方法很难成为一种常规检测技术。人们也在尝试着将一些新的方法引进到畜禽废水抗生素的检测中，例如，酶免疫分析方法和毛细管电泳分析方法等。酶免疫分析方法具有简便、灵敏、快速以及成本低的优点，但是其检测的结果还要通过MS的验证才能确证，而且国内对试剂盒的使用主要还是从国外进口，价格昂贵。我国是一个农业大国，畜禽养殖业正在从分散式向集约化模式转变，畜禽养殖废水量不断的增长，抗生素对周围水体的污染将会更加的严重。现有的检测技术还不能完全检测到水体中的各种类的抗生素，所以随着科学技术发展以及社会对畜禽废水中抗生素污染的重视，一种简便、快速、准确、高效以及廉价的检测方法，将是我国今后研究和开发的目标。

4. 牛奶抗生素检测有什么好方法

牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法 随着奶牛饲养业的发展，抗生素在预防和治疗奶牛疾病方面得到广泛的应用。生鲜牛奶中抗生素的来源主要是：第一，治疗泌乳期病牛时使用的抗生素会从奶牛体内移行到乳腺残留进入牛奶中，资料表明治疗后的奶牛，其挤出的牛奶5天内都有抗生素残留；其二，为了预防奶牛疾病并提高产量，在奶牛饲料中添加抗生素也会造成牛奶中抗生素的残留；第三，由于牧场管理不善，挤奶、储奶没有严格的卫生制度和配套的设施，人为添加或造成牛奶抗生素的污染。 牛奶中含有抗生素，不仅对人的健康造成很大的危害，而且对乳品加工企业带来经济损失（因无法生成酸奶和奶酪）。因此必须严格控制牛奶中抗生素残留，除了要做好科学饲养、精心管理；正确挤奶和预防疾病外，还要规范抗生素的使用，按国标中有关规定，用药后的奶牛5天后所产的牛奶才可作为原料乳，并且要检测其残留。世界粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）、欧盟（EC）及美国的食品和药品管理局（FDA）等对食品中抗生素最大残留量都有明确的规定，我国也有鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27—94）。 目前，鲜奶中抗生素残留的检测方法大致分为三类：生物测定法（微生物测定法、放射受体测定法）、免疫法（放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法）、理化分析法（波谱法、色谱及联用技术）。下面介绍几种常用的牛奶中抗生素残留检测方法。 TTC法 TTC法是我国鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27—94）的检测法，属生物检测法。其测定原理基于抗生素对微生物的抑制作用。如果牛奶中含有抗生素，则加入菌种（嗜热链球菌）经培育2.5~3小时后,加入TTC指示剂(三苯基四氮唑)不发生还原反应,所以样品呈无色状态;如果牛奶中不含抗生素,则样品呈红色.这样实验后样品颜色不变的为阳性,样品染成红色的为阴性。 TTC法的具体操作步骤: 1.菌液制备:将单菌种(嗜热链球菌)以脱脂乳为培养基,在36±1℃培养箱中培养15小时后,再以脱脂乳以至于1:1稀释待用; 2.取待检样液9mL,在80℃水浴加热5分钟后冷却到37℃以下,加活菌液1mL,在36℃±1℃水浴2小时,加入4%的TTC指示剂0.3mL, 36℃±1℃水浴培养30分钟; 3.若样液颜色不变为阳性,呈红色为阴性;若阳性的样液,再置于水浴中培养30分钟,不显色的为阳性,呈红色为阴性. TTC法测定各种抗生素的灵敏度为:青霉素:4ppb,链霉素:500ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:5000ppb.它具有费用低,易开展的优点;缺点是耗时长，要求操作人员需有一定专业知识且实验过程中菌液的制备、水浴过程控制都要求严格遵守操作规程，否则易出现假阳性，以致出现检验结果的不稳定性。 Delvotest? sp法（戴尔沃检测法） 该法最早在香港传到广东的，其使用是基于20世纪80年代初香港要求广东出口的生奶必须“无抗”且要求采用Delvotest法检测。该方法也是生物测定法，其试剂是由荷兰DSM公司生产并由AOAC认证。原理是利用微生物—嗜热芽胞菌在64℃条件下培养2.5～3小时后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若牛奶样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素, 嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸,指示剂将不变色. Delvotest? sp 法的操作步骤: 1.以无菌操作将一片营养药片夹放入小试管内; 2.用微量移液管将0.1mL牛奶样品注入小试管内; 3.把小试管放入已预热至64℃的水浴箱或恒温器中培养; 4).定时3小时取出观察颜色变化.如果底部2/3的固体介质是黄色,则为阴性, 如果底部2/3的固体介质是紫色,则为阳性. Delvotest? sp 法具有广谱性,可检测到?-内酰胺类抗生素在内的更多抗生素,如磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素等，其中对青霉素和磺胺类抗生素特别灵敏. 其灵敏度为：青霉素:3ppb,链霉素:300ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便，严格实用，容易判断，结果可靠，费用适中等优点；但也易出现假阳性，实验证明：当牛奶样品中添加微生物防腐剂（如乳酸链球菌素—Nisn）或样品中有足够的洗涤剂残留时，便可影响嗜热芽胞菌生长而使实验为阳性。 Snap?法 该方法是酶联免疫法，由美国IDEXX公司生产其检测分析仪及其试剂盒，均获得AOAC认证，它利用了竟争酶联免疫技术。其基本原理是用特异性抗体将固相载体激活，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原在45℃±5℃共同保温，使样品内的抗生素与内置抗生素标志物竟争与固定的抗体结合，然后进行洗涤和显色，内置抗生素标志物与固定的抗体结合形成的复合体，通过酶的作用分解可形成有色物质，通过测定色度并与参照物对照，就可以确定结果是阳性或阴性。 Snap?法操作步骤： 1.加入乳样于样品管中,摇匀,加热样品和检测板5分钟; 2.加入乳样于样品孔中,当激活圆环开始退却时,按Snap键; 3.反应4分钟,由Snap?读数仪读取并打印结果.检测读数小于1.05时判为阴性,大于1.05时判为阳性. Snap?法是一种将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法,其敏感性和特异性好,检测的灵敏度以普遍使用的?-内酰胺类计：青霉素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨苄西林:10ppb,头孢西林:8ppb.其他抗生素如四环素等的检测,则需购买相应的试剂来检测. Snap?法检测结果快速准确, 9分钟内即可检测出牛奶中?-内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素的残留含量，且有半定量的读数，可监控牧场用药的情况；检测仪器稳定性良好，结果重现性高，整个检测过程简单方便；但需购置专用仪器和试剂，成本较高。 高效液相色谱检测法 它是一种理化检测方法,是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应来测定其含量.检测的过程采用了气相色谱理论,通过高压液相和高灵敏度的检测器,分离速度快、效率高和操作自动化。一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤，能检测抗生素的具体含量，敏感性较高，但检测程序复杂，费用较高，需购买色谱仪等检测设备，不适合小型检验室。 传统的抗生素检测方法不少,有的操作烦琐,有的实验条件要求高,有的检验时间太长;这些不仅会给乳制品生产企业造成经济上和时间上的损失,而且检测结果常常会被原辅材料和人为操作等因素所影响.鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题,乳品企业及牧场应重视和加强检测工作,应用一些简单、快速和准确性高的方法来监控产品的质量，保证消费者的健康。 纳米胶体金层析法 该方法是基于竞争法胶体金免疫层析技术，将检测液加入试纸卡上的样品孔，检测液中的抗生素与金标垫上的金标抗体结合形成复合物，若抗生素在检测液中浓度低于100ng/mL，未结合的金标抗体流到T区时，被固定在膜上的抗生素BSA偶联物结合，逐渐凝集成一条可见的T线；若抗生素浓度高于100ng/mL，金标抗体全部形成复合物，不会再与T线处抗生素BSA偶联物结合形成可见T线。未固定的复合物流过T区被C区的二抗捕获并形成可见的C线。C线出现则表明免疫层析发生，即试纸有效. http://www.quicking.cn/chinese/content.asp?MoleType=3&ChannelID=3&id=174 胶体金法操作步骤： 1．将采集的牛奶样品进行编号，置于常温（20-30℃）室内。（低温牛奶流动性差，不适合进行试纸层析测试） 2．摇匀牛奶，用吸管取1mL加入到离心管中，7000rpm离心3-4分钟至分离出脂肪层。脂肪层下5mm处液体（脱脂牛奶）即为待测液。 3．取出试纸条，用吸管吸取3滴待测液滴于加样孔中， 4．5分钟后判断结果，10分钟后的结果无效。 http://www.quicking.cn/chinese/content.asp?MoleType=3&ChannelID=3&id=156 结果解释 阴性：C线显色，T线肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性。 阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。 无效：C线不显色，无论T线是否显色，该试纸均判为无效。 保存和稳定性 4-30℃阴凉干燥处保存，不可冷冻，避免阳光直晒，生产日期起18个月内有效。 纳米胶体金层析法适用于样品的初筛，检测时间短，出结果速度快，且能在常温下保存18个月之久，操作简单，无需任何专业的技术，没有检测环境的需求不管是奶农还是奶站工作人员还是专业的检测人员，都可以方便使用。

5. 抗生素检测的主要方法

由于抗生素在废水中的浓度相对较低，所以抗生素的检测一般都是微量或是痕量分析，常采用具有高灵敏度的仪器进行检测。各研究机构对畜禽废水中抗生素的检测技术主要有色谱法和其联用技术、酶免疫分析法、毛细管电泳法等。 液相色谱法（LC）在废水抗生素的检测中是最常见的，LC具有分离效能好，检测速度快且重现性好的特点。LC法所用的检测器有紫外检测器(UV)，荧光检测器，以及二级管阵列检测器。
高效液相色谱-紫外检测器
高效液相色谱-紫外检测器联用检测技术是最早用于环境中抗生素的分离检测，由于其操作简便以及成本低，被用于畜禽废水中抗生素的检测。
液相色谱-荧光检测器
液相色谱-荧光检测器因为其检测限低所以也被用于畜禽废水中抗生素的检测，通常对本身具有荧光性的抗生素液相色谱-荧光检测器可以直接检测出，但是对于本身不具有荧光性或荧光性差的抗生素，需要对其衍生化来提高目标物的荧光特性以便检测。
液相色谱串联质谱技术
色谱可以用于多组分混合物的分离和分析，可以对有机化合物进行定量分析，但是定性较困难，质谱仪能够对单一组分提供高灵敏度和特征的质谱图，但对复杂化合物无分析能力。所以将色谱与质谱进行联用（或是串联质谱），对复杂化合物中微量和痕量组分的定性和定量分析具有重要的意义。
由于畜禽废水中有多种类的抗生素同时存在，利用色谱和质谱的联用技术可以提高抗生素的定性、定量分析的可靠性、准确性、灵敏度。 酶免疫分析方法具有操作简单，前处理简化，分析成本低、灵敏、特异性强、检测快速，不需要昂贵的仪器等，而且可以同时测定几个样品，但是酶免疫分析方法对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉，分析分子量很小的化合物和不稳定的化合物有一定的困难。
用酶免疫分析方法试剂盒检测地表水、地下水中的四环素和泰勒菌素，检测分别为0.05μg/L,0.1μg/L。其结果表明，该方法成本低、检测快，可用于水中的四环素、氯四环素、泰勒菌素的初筛检测。 经典的放射免疫测定基本原理和酶免疫分析是相同的，但所不同的是反应的放大指示系统不是酶和底物，而是放射性同位素。用于抗原或抗体标记的同位素通常是放射性较小的β放射原，最常用的是同位素是3H和14C，放射性不强、用量也极微小，比较安全。

6. 青霉素钠无菌检查的方法验证

目的 建立健全青霉素钠无菌检查方法，保证检验结果的准确性和可靠性。

方法 采用薄膜过滤法进行。

1.培养基及其制备方法

培养基应适合需气菌、厌气菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使用按该处 方生产的符合规定的脱水培养基。以下培养基制备时，均以115℃灭菌30分钟。 1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐流体培养基) 酪胨（胰酶水解） 15g 氯化钠 2.5g 葡萄糖 5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml L－胱氨酸 0.5g (或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml) 硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.5～0.7g (或硫乙醇酸0.3ml) 水 1000ml 酵母浸出粉 5g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH为弱碱性， 煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装， 灭菌。 在供试品接种前, 培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5，否则,须 经水浴煮沸加热, 只限加热一次。

2.选择性培养基

(1) 对氨基苯甲酸培养基（用于磺胺类药物的无菌检查） 照上述需气菌、厌气菌 培养基及真菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后，摇匀,分装,灭 菌。 (2) 聚山梨酯80培养基（用于油剂药品的无菌检查） 照上述需气菌、厌气菌培养基 及真菌培养基的处方及制法，各加10ml聚山梨酯80，摇匀，分装，灭菌。

3.操作

按该药品项下规定的方法处理后, 加入0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少100ml中, 混合后，通过装有孔径不大于0.45μm的薄膜过滤器，然后用0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜至阳性对照菌正常生长。将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基用阳性对照管用培养基分别加至薄膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份,分别加入上述二种培养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml(抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌)。阳性对照管细菌应在培养24～48小时，真菌应在培养24～72小时有菌生长。结果判断当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长，阴性对照管呈阴性时，可根据观察所得的结果判定。

结果判断 如需气菌、厌气菌及真菌培养基管均为澄清或虽显浑浊但经证明并非有菌生长,均应判为供试品合格；如需气菌、厌气菌及真菌培养基管中任何1管显浑浊并确证为有菌生长，应重新取2倍量供试品，分别依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。

讨论 目前，抗生素类药物的应用非常广泛，针对每种抗生素类药物建立严格的质量标准，提高抗生素的质量就显得尤为关键。所以对一个新品种建立无菌检查法时，对其方法进行验证就显得尤为必要。薄膜过滤法作为无菌检查中的一种方法，具有准确、方便、快捷的优点，是无菌检查时所采用的一种重要方法。试验表明上述方法操作方便快捷、结果准确。所以，该无菌检查方法验证对保证结果的可信度和准确性具有重要意义。

7. 青霉素钠无菌检查的方法验证

青霉素钠无菌检查的方法验证
目的 建立健全注射用青霉素钠无菌检查方法，保证检验结果的准确性和可靠性。方法 按中国药典2010年版二部(附录XI H)无菌检查法中的薄膜过滤法进行。
1 试验环境与材料
1．1 试验环境在环境洁净度万级、局部洁净度百级的单向流空气的菌无室中进行。
1．2 仪器智能集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)、PY330一次性全封闭集菌培养器(杭州泰林生物技术设备有限公司)、生化培养箱(苏州威尔实验用品有限公司)、霉菌培养箱(苏州威尔实验用品有限公司)、生物安全柜(苏州安泰空气技术公司)
1．3 试药注射用青霉素钠
1．4 试验用菌株金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003l、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、生孢梭茵[CMCC(B)64 941]、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]、黑曲霉[CMCC(V)98 003]。
1．5 培养基、稀释液及缓冲液1．5．1 干粉培养基 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、琼脂粉。
1．5．2 细菌稀释液0．9％ 灭菌氯化钠溶液。
1．5．3 冲洗用缓冲液pH7．0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
2 方法与结果
2．1 菌液制备按中国药典2010年版附录ⅪH无菌检查法菌液制备法制备 。
2．2 菌落计数取金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌菌液、枯草芽孢杆菌菌液各1 m1分别接种于营养琼脂培养基中，生孢梭菌接种至含1．5％琼脂的硫乙醇酸盐流体培养基中，30~C～35'E生化培养箱培养24～48 h，取白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液各1 m1分别接种至改良马丁琼脂培养基中，经23℃ 一28~C霉菌培养箱培养48～72 h，计数。(上述各菌液分别接种两个平板，取平均值，同时设阴性对照)
2．2 方法学验证
2．3．1 试验组(样品+阳性) 取一次性全封闭集菌培养器(三联装)一套，先用少量pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜，取样品15瓶溶解于250 ml缓冲液中，按薄膜过滤法过滤，样品过滤完毕后，再用pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次每管注人冲洗液100 ml，充分振摇，完全排空后循环操作5次，总冲洗量达到500 ml每管。冲洗完毕后在2管中分别注人改良马丁培养基100 ml，另1管中注入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml。另取一套集菌培养器(三联装)取本品依上述方法过滤并冲洗后，均注入硫乙醇酸盐流体培养基100 ml，将上述6管集菌培养器移至阳性对照室，于含硫乙醇酸盐流体培养基的集菌培养器中，分别接种金黄色葡萄球菌菌液、大肠埃希菌茵液、枯草芽孢杆菌菌液、生孢梭菌菌液各1 ml，于含改良马丁培养基的集茵培养器中，分别接种白色念珠菌菌液和黑曲霉菌液各1 ml，按前述规定温度培养3～5 d，观察结果。
2．3．2 阳性对照组取一次性全封闭集菌培养器(三联装)二套，4管中分别注入硫乙醇酸盐流体培养基各100 ml、2管中分别注入改良马丁培养基各100 ml，在阳性对照室内将6种菌液分别接种至相应管内，作为阳性对照，按前述规定温度培养3～5 d，观察结果。
2．3．3 阴性对照组取一次性全封闭集菌培养器(二联装)一套，滤过适量缓冲液后分别注入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100 ml，作为阴性对照，按前述规定温度培养14 d，观察结果。
2．3．4 样品的无菌检查 取样品15支依上述方法同法操作，以500 ml／管的冲洗量冲洗，加入培养基后，按规定温度培养14 d，逐日观察，若培养14 d均澄清；由此判定供试品符合规定。
结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。
讨论 目前，抗生素类药物的应用非常广泛，针对每种抗生素类药物建立严格的质量标准，提高抗生素的质量就显得尤为关键。所以对一个新品种建立无菌检查法时，对其方法进行验证就显得尤为必要。薄膜过滤法作为无菌检查中的一种方法，具有准确、方便、快捷的优点，是无菌检查时所采用的一种重要方法。试验表明上述方法操作方便快捷、结果准确。所以，该无菌检查方法验证对保证结果的可信度和准确性具有重要意义。

8. 无菌药品的生产过程验证内容有哪些

无菌药品的生产过程验证内容：为保证药品的微生物检测检验的质量，必须对所有的检测方法进行验证，只有检测方法验证确认后才能确保验证结果的准确、可靠。我国的《药品生产质量管理规范》（1998年修订）第五十八条规定：“产品的生产工艺及关键设施、设备应按验证方案进行验证。当影响产品质量的主要因素，如工艺、质量控制方法、主要原辅料、主要生产设备等发生改变时，以及生产一定周期后，应进行再验证。第五十九条：应根据验证对象提出验证项目、制定验证方案，并组织实施。验证工作完成后应写出验证报告，由验证工作负责人审核、批准。第六十条：验证过程中的数据和分析内容应以文件形式归档保存。验证文件应包括验证方案、验证报告、评价和建议、批准人等”。
《中国药典》（2005年版）附录《药品质量标准分析方法验证》中明确指出：“药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求，在建立药品质量标准时，分析方法需经验证；在药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。方法验证理由、过程和结果均应记载在药品标准起草说明或修订说明中”。此外，《中国药典》（2005年版）的药品无菌检查法和微生物限度检查法中也明确规定了无菌检查法方法验证试验和微生物限度检查法方法的验证内容：“当供试品为新的产品或供试品的检验条件发生改变时，应进行方法验证试验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。供试品对每一试验菌的抑菌程度应逐一进行验证”；“当供试品为新的产品或供试品的检验条件发生改变时，应进行方法验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。验证时，按供试品的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证”。为何规定要进行方法学的验证？这是由于许多药品本身具有抑菌性（如抗生素类药品、含防腐剂药品）会对检查结果带来影响，因此在进行微生物检测前，需要对样品进行适当的预处理以消除样品本身对微生物检测所带来的干扰。同样，样品的预处理方式、检验条件和培养条件也都会影响到样品的微生物检测结果。因此，在确定新产品的微生物学检验时或开发新的检测方法时或原有检验条件发生改变时必须要加以验证，以确保在新产品的微生物学检验时或开发新的检测方法时或原有检验条件发生改变时的实际检验条件下，其检验方法的准确性、有效性和重现性。

9. 肉类抗生素检测方法有哪些

一种基于冰箱的肉类抗生素检测方法,将紫外激发光源和光谱相机安置于冰箱内部上壁,将肉类放置在冰箱内,开启光谱相机,连续采集n帧数据,每帧数据为八通道光谱图像,将每个通道取平均来降低紫外激发光源波动及光谱相机偏置噪声,获得八通道背景光谱数.

10. 药品领域的微生物检测及标准

中国药典微生物限度检查法，为《中国药典》附录收载的关于药品微生物检查的法定方法。药品的不同剂型的微生物检测标准不同，具体如下：

1、制剂通则品种

制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。

2、口服给药制剂

细菌数每1g不得过l000cfu。每lml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数每lg或lml不得过100cfu。

大肠埃希菌每1g或lml不得检出。

3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂

细菌数每1g、lml或l0cm²，不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数每1g、lml或l0cm²，不得过10cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml或l0cm²不得检出。

大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、lml或l0cm²，不得检出。

4、阴道、尿道给药制剂

细菌数每1g、lml或l0cm²，不得过100cfu。

霉菌数和酵母菌数每1g、lml或l0cm²应小于10cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌每1g、lml或l0cm²，不得检出。

5、直肠给药制剂

细菌数每1g不得过l000cfu。每lml不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数每1g或lml不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每lg或lml不得检出。

6、其他局部给药制剂

细菌数每1g、lml或l0cm²不得过100cfu。

霉菌和酵母菌数每1g、lml或l0cm²不得过100cfu。

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌每1g、lml或l0cm²不得检出。

7、含动物组织

含动物组织（包括提取物）的口服给药制剂每10g或10ml还不得检出沙门菌。

8、兼用途径制剂

应符合各给药途径的标准。

(10)抗生素检测方法验证扩展阅读

微生物限度检查法的注意事项：

1、当建立产品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。

2、检查项目应当包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

3、微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。

4、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

5、除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。

6、检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。