检测蛋白atp酶活性的方法

1. 酶活力测定的方式方法有哪些

测定酶活力，可用物理法，化学法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一，在适当的条件下，把酶和底物混合，测定生成一定量产物所需的时间，此即终点法。第二，将酶和底物混合后隔一定时间，间断地或连续地测定反应的连续变化，如吸收度的增加或减少。
第三，将酶与底物混合后，让其反应一定时间，然后停止反应，定量测定底物减少或产物生成的量。后两种方法称为动力学法或反应速率法：按取样及检测的方式可称为取样测定法或连续测定法。
（1）定时法：（两点法）

通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。其中t1往往取反应开始的时间。

酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，通过加入强酸、强碱、蛋白医学教育网整理沉淀剂等，使反应完全停止（也叫中止反应法）。加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。

该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或物的变化。

优点：简单易行，对试剂要求不高。

缺点：难保证测定结果的真实性。

难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。随着保温时间的延续，酶变性失活加速。

（2）连续监测法：

又称为动力学法或速率法、连续反应法。

在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。

连续监测法根据连续测得的数据，可选择线性期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。

因此连续监测法测定酶活性比定时法更准确。

实际工作中，采用工具酶的酶偶联法已经成为医学教育网整理应用最广、最频繁测酶活性浓度的方法。

（3）平衡法：

通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。

2. 酶活性分析的常用方法

一、量气法

在封闭的反应系统中如有气体变化，通过测量变化后的气体体积或压力很容易计算出气体变化量，这是量气法的基本原理。曾在检验科广泛应用的Van-slyke测二氧化碳结合力的方法就是量气法的一个典型例子。Warburg进一步加以发展，设计出专用于测定酶活性的华勃呼吸仪。这种仪器特别适用于测定那些在反应中产生或消耗气体的酶，例如氧化酶反应涉及到O2的消耗，脱羧酶会产生CO2。但也不仅限于这些酶，科学家采用与CO2气体保持平衡过的重碳酸盐体系，可用来测定各种产生H+的酶反应，如各种还原酶，可使NADH变为NAD和H+，而H+会促使反应体系中重碳酸盐变为CO2气体。

二、比色法与分光光度法

在20世纪上半个世纪华勃仪得到研究实验室广泛的应用，并在酶学上得到丰硕的成果。但此法操作烦琐，技术要求高而且灵敏度低。临床常规中很少使用。多使用简单易行的比色法测酶活性。在上半个世纪建立了一些适用于常规工作的测酶活性浓度的方法，如测定淀粉酶的Somogyi法，碱性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。这些方法都是在酶和底物作用一段时间后停止酶反应，加入各种化学试剂与产物或基质反应呈色，用比色计在可见光处比色，同时将被测物质作标准管或标准曲线，比较后计算出在此段时间内产物生成量或底物消耗量，从而求得反应速率v。

比色法从50年代起逐步被分光光度法所取代。这是因为分光光度法有以下几个显着优点：一是测定范围不只局限在可见光，还可扩展到紫外和红外部分。这就为扩大测定酶范围提供了可能性。二是提供了寻找一类不需停止酶反应就可直接测定产物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反应A－＞B＋C，A、B、C三种物质用分光光度法的吸收光谱如图17-1所示。

图17-1 A、B、C三种物质的吸收曲线

可以看到C在560nm处有一吸收峰，而A和B在此处无吸光度变化因此无需停止酶反应，只要在560nm处测定吸光度变化就很容易计算出C的变化速度，而且C物质比A、B二物质有更高的吸收峰，即灵敏度最高。

这类方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光谱差异建立的测酶活性浓度方法。NAD（P）H在340nm处有一吸收峰，而NAD（P）在此波段却毫无吸光性。因此建立了一类和原来比色法截然不同方法。不需停止酶反应，在340nm根据吸光度变化，就可观察到酶反应变化全过程。

第三个优点是不需要如比色法那样，作标准管或标准曲线，因为分光光度计使用近似单色光的光源，在此条件下，某一特定物质的吸光度为常数，即人们所熟悉的摩尔吸光度（molar absorbance）。根据此值从吸光度△A/△T不难计算出酶催化反应速度v。

分光光度计的这些简便、准确等特点使它在近年来已逐步取代比色法而成为目前最流行的方法。其缺点是需要精确带恒温装置的分光光度计，在经济不发达地区尚难推广。

分光光度法的技术多样化。设计得当可用于各种酶的测定。表17-2是一些可用于分光光度法的氧化还原物质特性。

除了前述的NAD(P)H系统可用于脱氢酶测定外，可利用黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）来测定各种含这二个辅基的酶。它们的氧化型在450nm有一很强吸收峰，而还原型的吸光度很低，同样细胞色素还原型在可见光有一个非常明显和很窄的吸收峰，都使人们很容易用分光光度法研究这些酶的作用。上述物质主要用于氧化还原酶的测定。

科学家还设计出一系列人工合成酶的底物，用于其它酶的分光光度法测定。例如合成了很多对硝基酚的衍生物，用于各种水解酶的测定。碱性磷酸酶底物磷酸对硝基酚就是一个成功例子。又如测芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸对硝基酚为底物，其分解产物的吸收峰由原来的278nm变为318nm，Webb成功地在330nm进行此酶监测

表17-2 一些氧化还原物质的特性

物质 波长（nm） 克分子吸光度
还原型 氧化型
NAD，NADP 340 6300 0
FMN 450 12200
FAD 450 11300
细胞色素C 550 29500 8300
亚甲蓝（等消光点） 610 0 41000
二氢酚吲哚酚 600 0 21000
吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000
抗坏血酸 265 15100
连二亚硫酸盐 314 8000 0
氰化铁（亚铁） 420 0 1020

分光光度法的上述原理还可以用于其它酶的测定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由于含不饱和键，在330nm处有很强吸收峰，而酶作用产物无此不饱和键。则不难在330nm处对这些酶进行直接测定。

此后在分光光度法的发展过程中又导入了酶偶联技术。使得分光光度法几乎能测定所有的酶。因此临床实验室工作者如不能很好掌握分光光度法的技术，不了解各种影响因素，要作好酶的测定是很困难的。

三、荧光法和同位素法

分光光度法有一个缺点，即灵敏度较低。有些标本中酶浓度很低时往往测不出来。此时可考虑改用荧光法，可将测定灵敏度提高2-3个数量级。如科学家合成了一系列甲基伞形酮的衍生物，可取代对硝基酚衍生物做为一些水解酶的底物，由于水解产物甲基伞形酮有强烈荧光，大大提高测定的灵敏度，就是分光光度法中最常用的NAD(P)H反应系统，也可改用荧光法，在340nm紫外线激发下NAD(P)H产生强烈的蓝色荧光，而NAD(P)不被激发。此外，还可使用在荧光法基础上发展起来的时间分辨荧光法，例如北京医院就曾利用此种灵敏度极高方法测定很难用其它方法检测的脑脊液中微量的烯醇化酶。荧光法不易掌握，对所用的试剂、容器和仪器都要求很高，否则易产生非特异荧光干扰测定，或者引起荧光的淬灭使测定不准，故此种方法多用于研究实验室，少用于常规实验室。为提高灵敏度，还可使用同位素标记的底物进行酶测定，例如，有人以C12标记的乙酰胆碱为底物测定胆碱酯酶，在酶作用后以离子交换法分离出含C14的乙酸。同位素方法由于对人体有害，操作麻烦，目前已很少使用。

四、其它方法

离子选择电极法，旋光法等有时用于测定特定的酶，当酶反应牵涉到有酸碱变化时，很容易用pH仪直接观察酶反应过程中H+的变化。直接用pH仪测酶反应有两个缺点：一是随pH变化，会偏离酶作用的最适pH值，不可避免地引起酶反应速度变慢。其二是如测定的标本不是纯酶时标本中其他蛋白及其它有缓衡能力的物质将会影响所测pH变化的程度。此时如改用电位滴定仪则更为适合。此仪器可在酶反应过程中不断向反应体系中加入酸或碱以维持反应体系pH的恒定，而加入的酸碱量只与体系中H+变化量相关，和反应体系中缓衡能力无关。

同样如酶反应中有O2变化，可使用氧电极来监测酶反应过程，这可用来测定葡萄糖氧化酶活性，Chappell还成功地将此技术用于测线粒体的氧化能力。还曾有人尝试用二氧化碳和氨电极测酶，由于这些电极反应时间较慢，不利于检测酶反应速度。有些酶的反应物为光学异构体，则可根据旋光度变化来追踪酶反应。某些反应物如羟基酸本身虽无旋光性，但与钼结合后产生很高的旋光性。根据此特性建立了测定延胡索酸水合酶的方法。还有个别酶的测定使用了极谱法、高效液相色谱法等。总之，实验室工作者完全可以根据实验室现有仪器和技术，创造性地建立一些新的测活性浓度的方法。

3. 求助：蛋白酶酶活的测定方法

酶活测定方法 还原法
酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。
色原底物法
通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。 粘度法
该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法
酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法
常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法
将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔。在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

4. 酶活力的常用测定方法

常用的测定方法有取样法和连续法。

1、取样法

在酶反应开始后不同的时间，从反应系统中取出一定量的反应液，并用适当方法停止其反应，再根据产物和底物在化学性质上的差别进行分析，求得单位时间内酶促反应的变化量。

2、连续法

基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过程中对反应系统添加酶的变性剂以终止反应，常用的连续测定法是光吸收测定法，即根据产物和底物在某一波长或波段上有明显的特征吸收差别而建立起来的连续观测方法，几乎所有的氧化还原酶都可用此法测定。

此外如荧光法、旋光法、电化学法也是常用的连续测定方法。对不易直接测定的反应，可使用酶偶联分析法，即用过量、专一的“偶联工具酶”，使被测反应继续进行到某一可直接测定的阶段。近年来，酶活性的测定工作正向两个方向发展，超微量酶活的灵敏测定，实现测定过程的自动化控制。

(4)检测蛋白atp酶活性的方法扩展阅读

酶活力的大小可以用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的转化速率来表示，即酶催化的转化速率越快，酶的活力就越高；反之，速率越慢，酶的活力就越低。所以，测定酶的活力就是测定酶促转化速率。酶转化速率可以用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。

酶活力的测定既可以通过定量测定酶反应的产物或底物数量随反应时间的变化，也可以通过定量测定酶反应底物中某一性质的变化，如黏度变化来测定。通常是在酶的最适PH 值和离子强度以及指定的温度下测定酶活力。

5. 酶活力的测定方法及原理

酶活力的测定方法：有两种主要方法即终止反应法和连续反应法。
终止反应法：是在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。
连续反应法：无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。
酶活性测定的原理：
1. 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的测定 SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。
SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。
2. 过氧化氢酶（Catalase，CAT）
活性测定 CAT 活性参照Aebi (1984)[7]的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL 。400 μL反应液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
3. 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的测定 PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。350µL反应液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，内含100µmol/L邻苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
4. 过氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。反应体系为30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）。反应在加入H2O2 后开始准确记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

6. 怎样检测蛋白酶活性

在适宜条件下(温度,pH),加入蛋清,若消失则有活性.

7. 测定酶活力要注意控制哪些条件

1、底物浓度：除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于［S］与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求［S］达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。

2、酶浓度：在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有［S］>>［E］时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。

3、温度：不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37～40℃。高于或低于最适温度，酶活性都降低。

4、离子强度和pH值：在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低。

一般采用电化学和光物理的方法

即利用反应物或产物的吸光性，用紫外分光光度法或荧光法测定。若酶反应过程中产物或反应物有气体，则可用测压仪(瓦氏呼吸仪)测定。若反应过程中生成酸，则可用电化学法。用同位素标记的底物则可用放射化学法测定底物浓度变化，计算酶活性。一些性质稳定的酶，也可用高效液相色谱法检测。

以上内容参考：网络-酶活性测定

8. 急！质膜ATP酶活性测定方法

方法 以波长7.1mm，功率密度为10 mW/cm2毫米波辐照人外周血淋巴细胞15、30、60分钟，并采用钙荧光指示剂Fura-2/Am定量测试法检测淋巴细胞内游离钙浓度和质膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性变化。结果

辐照后淋巴细胞内游离钙浓度明显低于正常(P＜0.05)；同时细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性增加(P＜0.05)；而且辐照后细胞内游离钙浓度降低与质膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶的激活呈负相关。结论 一定频率窗和能量窗的毫米波辐照激活细胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，使细胞膜对钙通透性发生变化，且影响到细胞内Ca2+贮存，造成细胞膜通透性和细胞功能的改变

9. 采用什么方法可以定量测定酶活性

酶活性测定的原理：
超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的测定 SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反应步骤为：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12μmol/L氮蓝四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保温2分钟后加入100μl核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2μmol/L 核黄素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50％为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。
SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。
过氧化氢酶（Catalase，CAT）
活性测定 CAT 活性参照Aebi (1984)[7]的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL 。400 μL反应液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25℃，pH7.0条件下1分钟分解1μmol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的测定 PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。350µL反应液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，内含100µmol/L邻苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。
过氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400μL。反应体系为30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）。反应在加入H2O2 后开始准确记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。

10. 采用什么方法可以定量测定酶活性

肯定是分光光度法噻~~~
根据酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm有一个吸收紫外吸收高峰！~在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比~~~然后有专门的蛋白质量和酶活力的换算公式，但是这种方法的准确性不是很好，试验中存在很多影响因素！！！！这种方法用于很多酶和蛋白质的测定，还可以用于某些dna和rna的定量测定哦~~~
荧光法一般用于体内酶促反应的酶和抗体的测定，通过酶等和底物的反应，把底物用荧光物标记起来，反应后在紫外线的激发下观察荧光的强弱，从而判断酶活力的大小，不过用于定性的测定为多~~~
酸碱滴定似乎没注意过，好像看到过测定脂肪酶的活性吧~~~通过用酸碱滴定法测定水解液的酸价，依靠指示剂的变化判断，而且有酸碱滴定操作肯定很麻烦~~~~
测压发法也没听到说过，不知道是怎么回事~~~
碘量法肯定用于淀粉酶的测定嘛~~~~~淀粉酶能水解淀粉，不会和碘反应产生蓝色的噻~~
然后还有什么质谱分析，hplc（高效液相色谱）等等，反正还有很多高科技的测定方法的~~~
最常用的就是分光光度法啦~~~~