内毒素检测方法验证方案

① 细菌内毒素检查方法是否必须做验证

细菌内毒素的检测必须进行验证方可用于产品验证，因每一个产品的所使用的细菌内毒素限值匀不一样，故须进行验证确定产品的细菌内毒素限值。并确定产品的最终稀释倍数。

② 中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点比较

中国药典和美国药典中的细菌内毒素检测法的不同点比较

1、细菌内毒素工作标准品（CSE）

CP 对CSE的用途及效价进行定义“细菌内毒素工作标准品中每1ng细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU”

USP未提

2、细菌内毒素检查用水

CP ： 与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水

USP：与鲎试剂在限定的灵敏度下不发生反应的灭菌注射用水或其它水。

CP：用于细菌内毒素定量测定用的细菌内毒素检查用水，内毒素含量应小于0.005EU/ml。

USP： 未提到。

3、实验用具的准备

CP：实验所用器皿需要经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。

USP：使用经验证的除热原程序对所有玻璃器皿和遇热稳定的材料在热空气烘箱中进行除热原，常用的最低温度和最少的时间是250℃下30分钟。

(2)内毒素检测方法验证方案扩展阅读

细菌内毒素检查法的注意事项：

在细菌内毒素检查方法的建立中，计算内毒素限值L、MVD和MVC时，需要注意最大人用剂量、产品规格、鲎试剂的灵敏度等重要的参数，因为计算错误会导致后续的所有努力均告失败。常见的问题有：

(1)临床用药剂量确定不正确，仅用常规用药剂量，未考虑临床可能的人体最大用药剂量和给药途径，在限值计算公式L=K/M中，由于对K值及M值的定义模糊，使K值及M值赋值不准确，最终导致限值计算错误。

例如，某注射剂临床成人每次静脉滴注给药40-80mg，婴儿(三个月以上)静脉滴注给药每次10-20mg。

按成人(体重60kg)剂量计算限值为3.75EU/mg，而婴儿体重仅为5kg左右，计算限值约为1.25EU/mg，如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量，细菌内毒素限值就会出现较大的差别。

(2)有的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来，而是根据同品种热原检查的剂量推算出来的，造成限值错误。

(3)有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来，没有考虑该品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异，也造成限值确定不正确。

(4)错误的计算日给药剂量(一日内多次给药)。

(5)在品种规格(浓度)发生变化时，计算MVD没有进行调整。

(6)建立方法时所用的最大给药剂量已经超出了临床所用剂量等。

③ 在检测内毒素中，哪些样品需要预处理方法是什么和检测方法

1、对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。
2、酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
3、内毒素凝胶法或定量法。

④ 求助：注射用水的细菌内毒素检查方法

《中国药典》规定注射用水细菌内毒素限值为：0.25EU/ml
因注射用水无干扰成分存在，可以不用稀释直接检测，最简便的方法是采用灵敏度0.25EU/ml的鲎试剂（TAL））直接检查。
即 取8支灵敏度为0.25EU/ml的TAL，每支加0.1ml细菌内毒素检查用水（BET水）复溶，再分别制样品管2支（直接加入1ml注射用水）；阴性对照管2支；阳性对照管2支；PPC管2支，按药典规定操作。
加果采用 灵敏度0.125EU/ml的鲎试剂 ，就要用BET水稀释一倍后再进行实验。

⑤ 内毒素的检测方法和原理

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法
细菌内毒素检查包括浊度法和显色基质法 供试品检测时 可使用其中任何一种方法进行试验 当测定结果有争议的时候 除另有规定外 以凝胶法结果为准
本实验操作过程硬防止微生物和内毒素的污染
凝胶法鲎试剂原理 鲎试剂为鲎科动物东方鲎变形细胞溶解物的冷冻干燥品 内含能被微量细菌内毒素激活的凝胶酶原和凝固蛋白源 在适宜的条件下（温度、pH值及无干扰物质）细菌内毒素能激活鲎试剂中的凝固酶原 使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶 凝胶法鲎试剂是根据凝集反应所形成凝胶的坚实程度来限量检测细菌内毒素

⑥ 内毒素检测原理是什么

内毒素测定方法有：
凝胶法
动态浊度法
终点浊度法
动态显色法
终点显色法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.5ml/支或者更大装量，使用时应加除热原水（细菌内毒素检查用水）复溶后使用。凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
动态浊度法、终点浊度法、动态显色法、终点显色法，这四种方法都是定量检测内毒素的。
根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。终点浊度法未见商品化产品。动态浊度法（又称动态比浊法）是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
终点显色法和动态显色法都是属于显色基质法。显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法，根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。厦门鲎试剂厂于2005年推出以鲎四肽为显色底物的鲎试剂盒，抗干扰能力强,
灵敏度高达0.005eu/ml,
质量达到国际领先水平。目前已有500多家单位使用该试剂盒，并有部分单位发表相应文献。国内有少量国外产品，但价格远高于国产试剂，到货周期长。
如果您仅需要检测样品的内毒素限量，可以选择凝胶法鲎试剂，通过确定内毒素限值及最大有效稀释倍数，做样品的干扰试验从而确定使用的鲎试剂的灵敏度。
如果您需要定量测定样品中内毒素含量则应选择显色基质鲎试剂盒或动态浊度法鲎试剂。
动态浊度法与动态显色法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件，例如，微板鲎试仪elx808及软件talgent
或gen5。动态浊度法与动态显色法简单方便、一步即成，线性范围宽。
终点显色法需要配套酶标仪或可见分光光度计进行检测。配套带有温育系统的酶标仪，如微板鲎试仪elx808，可减少试剂用量。

⑦ 简述快速检测食品和药品中可能存在的内毒素的方法和步骤

食品不用测内毒素，自然界中大量存在内毒素，通过食物进入人体并不影响人体健康，只有注射等方式进入人体血液的内毒素对人体有害，所以要检测注射类药品（注射液，疫苗等）的内毒素。测内毒素用鲎试剂，看要定量还是定性。厦门鲎试剂厂有定性和定量的鲎试剂可以检测内毒素，包括浊度法的。