磷酸化nfkb检测方法

1. NF- kB Signaling Pathways 你那篇文章 谢谢

NF-kappaB是一个大家族，包括：RelA(p65)、c-Rel、RelB、NF-kappaB1
(p50/p105)、NF-kappaB2 (p52/p100)。其中以RelA(p65)研究最为深入。
通常所说的是左边的经典途径，大致意思是这样：非激活状态下，RelA(p65)与一种名为IkappaB的蛋白结合，停留在胞浆中，不发挥转录活性。当炎症因子等刺激时，IkappaB的上游激酶IkappaB
kinase（IKK）磷酸化而激活。IKK使IkappaB降解。p50有核定位信号，没有了IkappaB的束缚，p50会拽着RelA(p65)往核里面跑。RelA(p65)识别特定的DNA序列，并结合上去，从而调控靶基因的转录（这些基因的启动子上含有RelA(p65)的结合序列：5’-GGG(A/G)(C/A/T)T(C/T)-3’）。
一般来说，NF-kappaB的激活促进细胞生长，许多抗肿瘤药物以NF-kappaB为靶点，有兴趣的战友可以找些相关文献来看看。然而，某些情况下NF-kappaB的激活却有诱导凋亡的作用。
在读这篇文章以前，我一直认为NF-kappaB的激活包括这样三个过程：
（1）NF-kappaB入核。
这个过程可以用Western
blot检测核蛋白中NF-kappaB的水平，或者免疫荧光看NF-kappaB的亚细胞定位。
（2）NF-kappaB结合到DNA上。
这个过程可以用EMSA或ChIP来检测NF-kappaB与DNA的结合能力。
（3）启动某个基因的转录。
这个过程可以用荧光素酶报告基因技术检测靶基因的转录水平。NF-kappaB对靶基因的调控不仅是促进的，还可以是抑制的。而NF-kappaB既有促生长又有促凋亡的作用，不仅是由于NF-kappaB选择性地结合促生长基因或促凋亡基因启动子，还可以是对靶基因的选择性地激活或抑制。至于如何选择，关键在于刺激因素。

2. 怎么测一个基因是不是nf-kb的下游基因

有几种方法可以选择：
1.EMSA：一般都是用P标记的探针，具有放射性，要是用生物素标记的话，放射性就小了，但是花的钱就多了。最重要的是放射性的问题，必须有磷屏，否则没法做。
2.western blot： 这个抗体应该用磷酸化的P65抗体，，因为只有磷酸化的蛋白才具有活性，你要是有钱的话，可以连总蛋白和磷酸化蛋白一起做，比较完善。
3.免疫组化： 也是可以的，原理跟western blot差不多。
4.双荧光素酶：还有一种更好的方法就是promega的双荧光素酶报告系统，采用海肾和萤火虫两种荧光素酶，一种报告目的基因，一种报告内参，很好的方法，但是很贵。
总体来说，做EMSA和双荧光素酶是最好的方法，算是定量，但是EMSA有放射性，双荧光素酶比较贵。western和免疫组化只能用来半定量，但是做的人比较多，也能发高水平的杂志，相对来说比较简单，也省钱。

3. 肿瘤细胞中能检测到磷酸化的nf-kb吗

尿路出血，尿中有恶臭味等才怀疑恶性肿瘤，一般的尿液常规检查，不含癌细胞的检查。

答案补充
是否已经确诊？胰腺癌的恶性的很高！

答案补充
不用说，你已经很明白的。

4. 怎么用elisa法测定大鼠nf-kb

大鼠NF-kB Rat NF-kB ELISA Kit
ELISA试剂盒说明：
1．检测原理：采用双抗体夹心ABC-ELISA法
2．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
3．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
4．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
5．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

5. 测nf-kb的核转录水平能不能测总的磷酸化和核的磷酸化进行比较

nf-kb是怎样实现入核调控基因转录的核因子kB(NF—kB)体系主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和调亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递.在多数细胞类型,NF－kB在胞浆与抑制性蛋白质结合形成无活性的复合物.当肿瘤坏死因子等作用于相应受体后,可通过第二信使Cer等激活此系统,而病毒感染、脂多糖、活性氧中间体、佛波酯、双链RNA以及前述信息传递途径中活化的RKC、PkA等则可直接激活NF－kB.激活过程是通过磷酸化抑制性蛋白使其构象改变而从NF－kB脱落,使得NF－kB得以活化.活化的NF－kB进入细胞核,与DNA接触,并启动或抑制有关基因的转录.

6. NF-kB信号通路的中文版本

哺乳动物的转录因子NF-kB家族由P50（P105的处理产物，两者都被称为NF-kB1）,P52(p100的处理产物,两者都被称为NF-kB2)，REL(也被称为cREL)，REL-A(也被称为P65)和REL-B组成。这些蛋白质二聚化后形成有功能的NF-kB。除了REL-B只能与P50或者P52有效的结合外，存在所有的同源或异源二聚体组合的可能性，并且都具有NF-kB 的活性。每一个NF-kB家族的成员都有一个保守的REL同源区（RHD），它包含三种类型的基序：结合特异性DNA序列的基序；二聚化的基序；和一个核定位的基序，也被称为核定位信号（NLS）。P50型的NF-kB1及P52型的NF-kB2 包含仅仅一个RHD，而REL、REL-A、和REL-B除包含一个RHD外，还包含一个转录活化区。在没有刺激的细胞中，大部分的NF-kB 二聚体通过与细胞质中三个抑制因子（IkBa、IkBβ、IkBε）中的一个结合而以无活性的状态存在。这些抑制因子通过它们的锚蛋白区与NF-kB二聚体结合，掩盖至少一个NLSs。原型抑制因子IkBa，也阻止其结合的二聚体与DNA的结合，并且通过其末端的一个氨基末端输出序列促进二聚体的出核作用。
各种信号通过降解IkBs的方式来活化NF-kB，活化的NF-kB然后进入细胞核内与DNA结合。IkBs首先是在IkBs激酶（IKK）催化下使其的两个保守的丝氨酸残基磷酸化。IKK是由一个调节亚单位，IKK-γ(也被称为NEMO)和两个催化亚单位IKK-a，IKKβ组成。接着IkBs在SCF-E3泛素化酶复合体的催化作用下多泛素化而被蛋白酶降解。活化的NF-kB转位到核内与与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录。包括多种病原的组分例如脂多糖，前炎性细胞因子，如TNF、IL-1及丝裂原等在内的多种信号活化这种途径。依赖Ikk-和IKK-降解IkBs的NF-kB活化途径被称为经典的NF-kB活化途径。其他的不被人所熟知的途径也能从IkBs中活化部分的NF-kB。这些途径包括 氨酸磷酸化诱导的IkBs解离途径和 蛋白激酶-2诱导的IkBs的流动加快的方式。释放后的NF-kB可以通过例如修饰自身的亚单位的方式来影响自身的转录激活效能。活化的NF-kB快速的诱导编码IkBa的基因的转录，因此产生高水平的自身抑制剂。新合成的自由的IkBa进入细胞核内，然后使DNA上NF-kB解离并且将NF-kB排出细胞核，因而恢复到静息状态。
广泛的IkBs家族也包括P50和P52前体形式的NF-kB1和NF-kB2，分别是P105和P100。除了P50和P52序列外，这些前体还包括IkB样的锚蛋白区，它抑制与其相关的NF-kB亚单位的活性。从前体产生P50和P52的过程还没有被人完全的理解，但他需要翻译时和翻译后的蛋白酶的加工处理活动。在翻译的同时有就会组成性的产生约等量的P50和P105，虽然这时P50还没有加工完成。P52的产生主要但不完全是由于信号诱导的P100的加工完成的。不像是IkBa、IkBβ、IkBε的降解，信号诱导的磷酸化及加工P100成P52不需要经典的IKK-γ依赖的信号途径。IKK-a和NF-kB诱导激酶（NIK）是必不可少的，但IKK-β和IKK-γ是不需要的。因而这个途径又被称为非经典的，替代的或者新的NF-kB活化途径。虽然非经典的途径并不作用于未经处理的P105，但经典的途径可以有时可以像降解IkBs那样被完全的降解，因此释放被结合的NF-kB家族成员。
REL-B很少与小IkBs结合，而P100是其主要的抑制子。非传统的途径加工处理P100产生P52-REL-B二聚体。肿瘤坏死因子超家族成员包括B细胞活化因子（BAFF，也被称为BLYS）、CD40配体、淋巴细胞毒素 和NF-kB受体活化因子配体（也被称为TRANCER）能够诱导P100的加工处理。
转自生物谷

7. NF-KB是什么

NF-KB（核因子激活的B细胞的κ-轻链增强）是一种蛋白质复合物，其控制转录的DNA，细胞因子产生和细胞存活。

NF-KB几乎存在于所有动物细胞类型中，并参与细胞对刺激的反应，如应激，细胞因子，自由基，重金属，紫外线照射，氧化LDL和细菌或病毒抗原。NF-KB在调节对感染的免疫应答中起关键作用。

NF-KB的不正确调节与癌症，炎症和自身免疫疾病，感染性休克，病毒感染和免疫发育不当有关。NF-KB也与突触可塑性和记忆过程有关。

(7)磷酸化nfkb检测方法扩展阅读：

NF-κB由Ranjan Sen（NIH）在诺贝尔奖获得者David Baltimore的实验室中通过其与B细胞中免疫球蛋白轻链增强子中的11碱基对序列的相互作用而发现。

核因子-kB（NF-kB），是细胞内重要的核转录因子。它参与机体的炎症反应、免疫应答，能调节细胞凋亡、应激反应，NF-kB过度激活，与人类许多疾病如类风湿关节炎、心脏与脑部疾病的炎症变化等相关，因此通过药物来抑制NF-kB信号转导通路，可能会成为治疗的手段。

NF-kB分子的N端含Rel同源域，参与其和DNA结合、参与二聚体化，能被NF-kB抑制物（TeB）结合、抑制；NF-kB分子内还有核输出域、核定位域、转位活性域等，C端有反式转录激活域。

p50/p65NF-KB能与靶基因启动子免疫球蛋白k轻链基因转录增强序列（kB序列）特异结合。RelA/c-Rel二聚体，能与靶基因启动子其他序列结合。

参考资料来源：网络-NF-kB信号通路

8. 测NF-kB P65的表达。急！！！！！！！

我帮你看了一下,如果是磷酸化的抗体,那肯定要买2个了.如果是没磷酸化的抗体,目前我还没有查到能一起抗2个的.他们是来自同一个转录本吗?

产品名称 货号 宿主 用途 规格 种类特异性 价格 说明书
Anti-Actiated NF-κB p65 (NLS specific) Rabbit pAb KC-5N02 Rabbit W 100 μl H, M, R 988元 详细资料
Anti-NF-κB p65 (Rel A) Mouse mAb KC-5N03 Mouse W 100 μl H, M, R 988元 详细资料
Anti-NF-κB p65 (Rel A) Rabbit pAb KC-5N01 Rabbit W 100 μl H, M, R 988元 详细资料
Anti-Phosoho-NF-κB p65 (Ser276) Rabbit pAb KC-5N05 Rabbit W, IHC 100 μl H, M, (R) 1488元 详细资料
Anti-Phosoho-NF-κB p65 (Ser536) Rabbit pAb KC-5N04

9. 请教NF-KB检测方法

NF-kB比较特殊，他基本上是ready-to-use，也就是胞内总有一定量的转录和表达，总在那里，但是被IkB所抑制不发挥作用，当信号来时，IkB被IKK磷酸化失活被泛素蛋白酶体降解，NFkB释放进入核发挥转录因子的作用
可参考下面的图
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/5e/NFKB_mechanism_of_action.png

因此对NF-kB的研究，如果只检测NFkB的WB就很难有结果了，而至少需要检测：

1. 胞内和核内NF-kB的量，也就是要区别核蛋白和胞浆蛋白，这个可以用WB；
2. 检测IkB的磷酸化，这个也可用WB，不过IkB有两个不同的泛素化位点作用不同，因此也不是很特异的方法；
3. 最经典的还是要做EMSA，直接检测NF-kB与DNA的结合，这个应该是目前最权威的试验了，推荐！！

10. 如何检测转录因子nf-kb从细胞质转移进入细胞核

mRNA通核孔细胞核转移细胞质主运输
解析：RNA蛋白质等物质通核孔进细胞核种式主运输
主运输针物质需要载体蛋白并且耗能