检测代谢路径的方法

‘壹’ 用放射性同位素标记法为什么能追踪细胞内物质代谢途径

用放射性同位素标记法为什么能追踪细胞内物质代谢途径
同位素示踪法（isotopic tracer method）是利用放射性核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法,示踪实验的创建者是Hevesy.Hevesy于1923年首先用天然放射性212Pb研究铅盐在豆科植物内的分布和转移.继后Jolit和Curie于1934年发现了人工放射性,以及其后生产方法的建立（加速器、反应堆等）,为放射性同位素示踪法的更快的发展和广泛应用提供了基本的条件和有力的保障.
一、同位素示踪法基本原理和特点
同位素示踪所利用的放射性核素（或稳定性核素）及它们的化合物,与自然界存在的相应普通元素及其化合物之间的化学性质和生物学性质是相同的,只是具有不同的核物理性质.因此,就可以用同位素作为一种标记,制成含有同位素的标记化合物（如标记食物,药物和代谢物质等）代替相应的非标记化合物.利用放射性同位素不断地放出特征射线的核物理性质,就可以用核探测器随时追踪它在体内或体外的位置、数量及其转变等,稳定性同位素虽然不释放射线,但可以利用它与普通相应同位素的质量之差,通过质谱仪,气相层析仪,核磁共振等质量分析仪器来测定.放射性同位素和稳定性同位素都可作为示踪剂（tracer）,但是,稳定性同位素作为示踪剂其灵敏度较低,可获得的种类少,价格较昂贵,其应用范围受到限制；而用放射性同位素作为示踪剂不仅灵敏度,测量方法简便易行,能准确地定量,准确地定位及符合所研究对象的生理条件等特点：
1.灵敏度高
放射性示踪法可测到10-14－10-18克水平,即可以从1015个非放射性原子中检出一个放射性原子.它比目前较敏感的重量分析天平要敏感108-107倍,而迄今最准确的化学分析法很难测定到10-12克水平.
2.方法简便
放射性测定不受其它非放射性物质的干扰,可以省略许多复杂的物质分离步骤,体内示踪时,可以利用某些放射性同位素释放出穿透力强的r射线,在体外测量而获得结果,这就大大简化了实验过程,做到非破坏性分析,随着液体闪烁计数的发展,14C和3H等发射软β射线的放射性同位素在医学及生物学实验中得到越来越广泛的应用.
3.定位定量准确
放射性同位素示踪法能准确定量地测定代谢物质的转移和转变,与某些形态学技术相结合（如病理组织切片技术,电子显微镜技术等）,可以确定放射性示踪剂在组织器官中的定量分布,并且对组织器官的定位准确度可达细胞水平、亚细胞水平乃至分子水平.
4.符合生理条件
在放射性同位素实验中,所引用的放射性标记化合物的化学量是极微量的,它对体内原有的相应物质的重量改变是微不足道的,体内生理过程仍保持正常的平衡状态,获得的分析结果符合生理条件,更能反映客观存在的事物本质. 放射性同位素示踪法的优点如上所述,但也存在一些缺陷,如从事放射性同位素工作的人员要受一定的专门训练,要具备相应的安全防护措施和条件,在目前个别元素（如氧、氮等）还没有合适的放射性同位素等等.在作示踪实验时,还必须注意到示踪剂的同位素效应和放射效应问题.所谓同位素效应是指放射性同位素（或是稳定性同位素）与相应的普通元素之间存在着化学性质上的微小差异所引起的个别性质上的明显区别,对于轻元素而言,同位素效应比较严重.因为同位素之间的质量判别是倍增的,如3H质量是1H的三倍,2H是1H的两倍,当用氚水（3H2O）作示踪剂时,它在普通H2O中的含量不能过大,否则会使水的物理常数、对细胞膜的渗透及细胞质粘性等都会发生改变.但在一般的示踪实验中,由同位素效应引起的误差,常在实验误差内,可忽略不计.放射性同位素释放的射线利于追踪测量,但射线对生物体的作用达到一定剂量时,会改变机体的生理状态,这就是放射性同位素的辐射效应,因此放射性同位素的用量应小于安全剂量,严格控制在生物机体所能允许的范围之内,以免实验对象受辐射损伤,而得错误的结果.

‘贰’ 微生物发酵代谢产物途径中间产物的测定方法

先经分离纯化得到你测纯物质（≥95%），再进行质谱、核磁、同位素等的检测，打出图谱，然后再进行解谱，空间结构的话还需要一些的反应！很复杂！

‘叁’ 研究微生物代谢途径常用的方法有哪些

微生物的代谢调节主要有两种方式：酶合成的调节和酶活性的调节.
酶合成的调节
【酶合成的调节】：微生物细胞内的酶可以分为组成酶和诱导酶两类.组成酶时微生物细胞内一直存在的酶,它们的合成只受遗传物质的控制,而诱导酶则时在环境中存在某种物质的情况下才能够合成的酶.例如,在用葡萄糖和乳糖作碳源的培养基本上培养大肠杆菌,开始时,大肠杆菌只能利用葡萄糖而不能利用乳糖,只有当葡萄糖被消耗完毕以后,大肠杆菌才开始利用乳糖,只有当葡萄糖被消耗完毕以后,大肠杆菌才开始利用乳糖.
酶活性的调节
【酶活性的调节】：微生物还能够通过改变已有酶的催化活性来调节代谢的速率.酶活性发生主要原因时,代谢过程中产生的物质与酶结合,致使酶的结构产生变化.这种调节现象在核苷酸、维生素的合成代谢中十分普遍.
总结
上述两种调节方式时同时存在,并且密切配合、协调作用的.通过对代谢的调节,微生物细胞内一般不会累积大量的代谢产物.

‘肆’ 如何利用KEGG定位基因属于哪个代谢通路

如何利用KEGG定位基因属于哪个代谢通路
代谢通路：目前在通路数据库(PATHWAY database) 中代谢通路是建立得最好的，有大约90个参考代谢途径的图形。每个参考代谢途径是一个由酶或EC号组成的网络。
利用如下方法可通过计算机构建出生物体特有 的代谢通路：
先根据基因的序列相似性和位置相关性确定基因组中酶的基因。
然后合理地安排EC号。
最后将基因组中的基因和参照通路中用EC号编号的基因产物 结合起来。

‘伍’ 代谢组学 如何查找代谢通路

帮您查了一个编程代码可以解决：
use my package clusterProfiler
http://bioconctor.org/packages/devel/bioc/html/clusterProfiler.html

> require(clusterProfiler)
> data(gcSample)
> gcSample[[3]]
[1] "4905" "10383" "10953" "645958" "7280" "10381" "5869" "5985"
[9] "23197" "290" "309" "10577" "23071" "121504" "2495" "653226"
[17] "84617"
> x <- enrichKEGG(gcSample[[3]])
Warning messages:
1: 'l2e' is deprecated, use 'list2env' instead
2: 'l2e' is deprecated, use 'list2env' instead
> summary(x)
pathwayID Description GeneRatio BgRatio
05130 hsa05130 Pathogenic Escherichia coli infection 4/17 59/5504
04145 hsa04145 Phagosome 5/17 159/5504
04540 hsa04540 Gap junction 4/17 90/5504
04962 hsa04962 Vasopressin-regulated water reabsorption 2/17 44/5504
pvalue qvalue geneID Count
05130 2.554952e-05 0.005397106 10383/7280/10381/84617 4
04145 8.823916e-05 0.009219728 10383/7280/10381/5869/84617 5
04540 1.352278e-04 0.010247594 10383/7280/10381/84617 4
04962 7.871612e-03 0.376048432 4905/5869 2

‘陆’ 研究代谢途径的互补测验是什么

需要更具体点，因为生物中的互补实验有好几个，
比如酵母双杂交的互补实验
又如蓝白斑的互补实验
又如双分子荧光互补分析技术等等 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术，是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多色荧光互补技术(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较。目前，该技术已用于转录因子，G蛋白βγ亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上。该方法利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。

‘柒’ 代谢组学的研究方法

代谢组学的研究方法与蛋白质组学的方法类似，通常有两种方法。一种方法称作代谢物指纹分析 （metabolomic fingerprinting），采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法，比较不同血样中各自的代谢产物以确定其中所有的代谢产物。从本质上来说，代谢指纹分析涉及比较不同个体中代谢产物的质谱峰，最终了解不同化合物的结构，建立一套完备的识别这些不同化合物特征的分析方法。另一种方法是代谢轮廓分析（metabolomic profiling）,研究人员假定了一条特定的代谢途径，并对此进行更深入的研究。
对于代谢产物来说，不仅只有质谱峰这个特征。更进一步说，质谱（MS）并不能检测出所有的代谢产物，并不是因为质谱的灵敏度不够，而是由于质谱只能检测离子化的物质，但有些代谢产物在质谱仪中不能被离子化。采用核磁共振（NMR）的方法，可以弥补色谱的不足。剑桥大学的Jules Griffin博士，正在使用质谱与核磁共振结合的方法，试图建立机体中的完整代谢途径图谱。Griffin用核磁共振检测高丰度的代谢产物，由于核磁共振检测的灵敏度不高，所以只用于分析低丰度代谢产物。
过去，只有毒理学方面的研究使用核磁共振，而质谱只在植物代谢研究中采用。如今，这两种方法在代谢组学研究中已经普遍使用。为在不同样品间进行有意义的比较，研究人员必须结合使用这两种方法获得的大量数据进行分析。此外，还需要结合基因组学研究获得的数据。
Gary Siuzdak博士在美国克利普斯研究院（TSRI）从事生物信息学问题的研究，他设计了一个分析来自不同样品代谢产物变化的实验方案。研究人员可以通过生物信息学软件XEMS比较不同的数据，从而识别出代谢产物。软件提供了所有代谢产物的分子量数据，这些代谢产物浓度因不同的个体而变化。公众可以从网上免费获取这些数据。
Siuzdak博士表示，他们正采用综合研究的方法进行代谢组学研究，试图检测出尽可能多的代谢产物，超越人们过去使用方法所能达到的目标。通过个体研究，希望能在一定程度上识别出与应激有关的新分子，这些应激物可能是一种疾病，一种敲除酶，或者是其他的物质。

‘捌’ 如何查找一个基因参与的代谢通路

代谢通路：目前在通路数据库(PATHWAYdatabase)中代谢通路是建立得最好的，有大约90个参考代谢途径的图形。每个参考代谢途径是一个由酶或EC号组成的网络。

利用如下方法可通过计算机构建出生物体特有的代谢通路：

1. 先根据基因的序列相似性和位置相关性确定基因组中酶的基因。

2. 然后合理地安排EC号。

3. 最后将基因组中的基因和参照通路中用EC号编号的基因产物结合起来。

   
   

‘玖’ 研究微生物的某一条代谢途径，最简单的方法是什么是否一定要用到同位素标记法

最简单的方法是破坏这条代谢途径所需的酶。
不一定使用同位素标记法，可以使用上述方法。

希望能帮助你。^__^

‘拾’ 转录组分析怎样寻找代谢通路基因

般的转录组测序可以得到大量差异表达基因和调控代谢通路，但由于基因与表型难以直接关联，导致关键信号通路难以确定，因此往往达不到预期研究目的。相信很多做过转录组测序的老师都深有体会。总感觉中间缺少了一步？没错，就是代谢物！代谢物是基因型与表型之间的桥梁，代谢物的变化更能直接揭示基因的功能，因此能够更有效地揭示生物学及其生化、分子机理。在植物研究中，目前代谢组+转录组的策略已经被广泛运用于植物生理、生长发育、及逆境胁迫研究中。
那么如何进行代谢组与转录组的关联分析？总的来说，是基于“参与同一生物过程中的基因或代谢物具有相同或相似的变化规律”这一原理进行分析的。举个例子，研究不同颜色品种的菊花颜色差异的原因，首先通过代谢物检测，发现不同颜色品种的菊花积累的花青素类型和含量并不一致；然后进行转录组测序，在众多差异基因及代谢通路中，我们可以重点研究与花青素合成相关的代谢通路上的基因，从而一方面快狠准地找到导致颜色差异的功能基因，另一方面代谢组的结果也相当于是对转录组结果的验证。