t细胞抗原检测方法

Ⅰ 常用于鉴定和检测T细胞的表面分化抗原有哪些

常用于鉴定和检测T细胞的表面分化抗原有哪些
T细胞分化抗原测定
【中文名称】
T细胞分化抗原测定
【概述】
T细胞膜表面有100多种特异性抗原，现已制备了多种单克隆抗体，WHO（1986）统称为白细胞分化抗原（cluster differentiation，CD）。例如CD3代表总T细胞，CD4代表T辅助细胞（TH），CD8代表T细胞毒性细胞（TC）等。应用这些细胞的单克隆抗体与T细胞表面抗原结合后，再与荧光标记二抗（兔或羊抗鼠IgG）反应，在荧光显微镜下或流式细胞仪中计数CD的百分率。
【参考值】
免疫荧光法（IFA）：CD3为63.1%±10.8%；CD4（TH）为42.8%±9.5%；CD8（TS）为19.6%±5.9%；CD4/CD8（TH/TS）为（2.2±0.7）/1。流式细胞术：CD3为61%～85%；CD4为28%～58%；CD8为19%～48%；CD4/CD8为0.9～2.0/1。
【临床意义】
①CD3降低：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎等。
②CD4降低：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者。
③CD8减低：见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病。
④CD4/CD8比值增高：见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒性感染、变态反应等；CD4/CD8比值减低：见于艾滋病（常<0.5）。
⑤监测器官移植排斥反应时CD4/CD8比值增高预示可能发生排斥反应。

Ⅱ t细胞如何识别抗原

你好，T细胞当然具有免疫的作用了，识别抗原,产生淋巴因子,增殖分化成效应T细胞( 消灭靶器官靶细胞)和记忆细胞。成熟T细胞表面具有特异性识别抗原并与之结合的分子结构，称为T细胞抗原受体，该受体可以与抗原特异性结合，也就达到了识别抗原的效果。
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Ⅲ 免疫学的检测方法有哪些

免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫。

Ⅳ 简述T细胞功能测定的常用方法

免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测定。1．体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子参与下出现反应，从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。此外，尚包括检测体液中的各种可溶性免疫分子，如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等。2．细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞（T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等）表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等，测定各种免疫细胞及其亚群的数量和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。体液免疫检测法1.凝集反应。颗粒性抗原（细菌或红细胞等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下形成肉眼可见的凝集物，称之为凝集反应。1）直接凝集反应。颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象，前者多为细胞表面的结构成分，如细菌或红细胞的表面结构抗原。⑴玻片法：多用于抗原的定性检测。⑵试管法：多用于抗体的定量检测。2）间接凝集反应。将可溶性抗原吸附于载体颗粒（如乳胶颗粒、红细胞等）的表面，称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合，即可出现凝集现象。这个反应常用于测定细菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等）。根据凝集反应的原理，还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。2．沉淀反应。可溶性抗原（外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下，形成沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原多为多糖、类脂、蛋白质等。1）单向扩散试验。这是一种抗原定量试验，是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩散的沉淀反应。此法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量。2）双向扩散试验。这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。本法常用于定性试验，如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。单克隆抗体技术3）对流免疫电泳。对流电泳是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等。3．中和试验。特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性，抗体使相应抗原的毒性或传染性消失的反应为中和试验。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗体可使病毒失去感染性等。诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。乙型溶血性链球菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”，该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O”抗体所中和而不出现溶血。试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合，作用一段时间后加入人红细胞，红细胞不被溶解为阳性反应，表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。血清抗体效价达400单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌，有助于风湿热的诊断。4.免疫荧光法（荧光抗体法）。是应用荧光素染料（如异硫氰酸荧光黄等）来标记抗体，但不影响其活性，此种抗体称荧光抗体。用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原即与此种抗体发生特异性结合，形成复合物而粘着在细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物，可达到诊断或定位的目的。包括直接法和间接法。5．酶联免疫吸附试验。本法的原理是利用酶（常用辣根过氧化物酶）标记的抗原或抗体，以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。有间接法、双抗体法、竞争法三种。6．溶血空斑试验。7．免疫印迹技术。免疫印迹或免疫转印技术(immunoblotting或Westernblot）是在Southern(1975)抗体抗原反应创建的DNA印迹术(Southernblotting）基础上发展起来的新型免疫生化技术。细胞免疫检测法近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术，不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术，用于检测各类免疫细胞的表面标志（包括抗原及受体）、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。这些技术为深入研究和认识机体免疫系统的生理、病理改变，阐明某些疾病的发病机制和临床诊治提供了有用的手段。随着细胞免疫学的迅猛发展，时有新的细胞免疫检测技术出现。二十一世纪初期，新发展的项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面的检测。1．淋巴细胞转化试验。人类淋巴细胞在体外与特异性抗原（如结核菌素）或非特异性有丝分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T细胞即被激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最后导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴母细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪来确定掺入量以确定淋巴细胞转化率。2000年开始出现一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法。MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色成分。该产物的多少与活细胞数成正比，结果可用酶标仪(595nm）测量光密度，作为MTT法的指标。2．E-花环法。人类T细胞表面有羊细胞受体(CD2）能与羊红细胞结合形成玫瑰花样结构。即将分离液分离出的外周的单个核细胞悬液与羊红细胞在体外混合，经37℃培养5～10分钟后放4℃过夜，取细胞悬液计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞，此法可用来分离T细胞。3．T细胞亚群检测。4．细胞毒试验。Tc细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞等对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。抗体制备常用的检测方法是51Cr（铬）释放法，将51Cr-Na2CrO4盐水溶液与靶细胞（不同的细胞需不同的靶细胞，如NK细胞的靶细胞为K562），于37℃培养1小时左右，51Cr即进入靶细胞，与胞浆结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待测细胞毒的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50:1或100:1），靶细胞杀伤越多，释放到上清液中的游离51Cr就越多，且不能再被其他细胞吸收，用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值。5．巨噬细胞吞噬功能的测定。将中药(10%斑蝥）乙醇浸出液浸渍的滤纸（1cm2大小）置于受试者前臂屈侧皮肤上，4～5小时后取下滤纸。48小时内皮肤局部可水泡，内含巨噬细胞。取水泡液0.5ml加鸡红细胞悬液0.01ml，37℃经30分钟后作涂片、染色与镜检，计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观察。6．移动抑制试验。致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时，可以产生移动抑制因子(MIF）。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动，使之定位于局部而增强其免疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后，有无MIF产生，以测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能。7．时间分辨荧光测量技术。时间分辨荧光测量技术(time-resolvedfluorometry,TrF）是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相仿，但无放射测量的弊端，故问世虽短，进展却极为迅速，有取代放射测量之势。8．细胞因子检测技术。细胞因子的检测，2005年起在中医临床及实验室中已广泛应用。9．细胞受体的检测。受体是细胞表面标志之一，通过对受体的检测，可以了解细胞的功能，并为某些疾病的发病机制提供一定的理论依据。

Ⅳ 如何检测人t细胞的数量，功能及特异性

----T细胞可以（它可以被抗原刺激,把信息传递给B细胞分化成效应B细胞）
----效应T细胞可以（它可以感应到抗原是否进入靶细胞,从而去激活靶细胞的溶酶体酶）
----B细胞可以（它可以直接被抗原刺激,直接分化成效应B细胞）
----效应B细胞不可以（只能分泌抗体,只针对一种抗原,不能识别抗原）
----吞噬细胞不可以（争议对大的就是这个,有人说得有人说不得,但我觉得是不可以的,因为它只会吞入一切侵入体内的抗原,有时候花粉灰尘都吞,病不能识别特异性抗原和异物）

Ⅵ 如何从基因水平蛋白质水平及生物学活性等方面检测t细胞受抗原刺激后所产生的il 2

【摘要】 用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。 【关键词】 雷公藤内酯醇； 14位羟基修饰； 人工抗原； 多克隆抗体 雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。已有的TP结构 活性研究显示，TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团。研究证实，对于12，13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇（triptriolide）会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性。14位羟基是TP最容易被改造修饰的基团，研究表明，14位羟基被改造为水溶性的基团作为前药能极大改善小分子的水溶性，促进体内代谢，降低毒性，甚至能改善TP在体内的免疫抑制活性和抗肿瘤活性［1 2］。 综合考虑，TP的14位羟基是最合适的偶联基团。TP的水溶性不理想，且14位羟基不容易在温和条件下和蛋白载体反应，我们首先对14位羟基进行结构修饰，改造为水溶性的羧基，利用缩合反应偶联阳离子化牛血清白蛋白（cationized BSA，cBSA）和鸡卵清蛋白（OVA），合成TP的免疫抗原TP cBSA和检测抗原TP OVA。用免疫抗原免疫小鼠，顺利得到了TP的多抗。 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 TP（购自SIGMA公司），cBSA（购自PIERCE公司），OVA，1 乙基 （3 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂(FIA)，6～8周龄BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学中心）,Sephadex凝胶柱（购自PIERCE）。TP、OVA、1 乙基 （3 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂（FIA）均购自Sigma公司，cBSA、Sephadex凝胶柱均购自PIERCE公司，6～8周龄BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。 岛津UV 2550紫外可见分光光度计，Eppendorf Centrifuge 5415R离心机，TECAN SAFIRE自动酶标仪。 1.2 TP 14位羟基的修饰以及修饰产物的质谱鉴定 将TP的14位羟基进行衍生化修饰，在弱碱性条件下和丁二酸酐进行酰化反应，反应式如图2所示，得到水溶性分子triptolide 14 succinate（mTP），用质谱鉴定反应产物。 1.3 TP人工抗原的制备 碳二亚胺（EDC）法偶联mTP与蛋白载体（以cBSA为例，OVA合成的方法类似）： 取5 mg mTP和2.5 mg cBSA溶解在250 μl TE buffer（pH 8.0）中，充分震荡使其溶解，再取EDC·HCl 79 mg充分溶解于250 μl TE buffer（pH 8.0）中。将mTP和cBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液，在37 ℃摇床中反应2 h以上。先用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的mTP小分子，再透析纯化，将0.5 ml 溶液在PBS中透析3 d，每天换液两次，每次换液200 ml。透析产物小剂量分装，于－20 ℃保存备用。 1.4 人工合成抗原的紫外鉴定 用紫外分光光度法对cBSA标准品、偶联产物和mTP进行紫外扫描，根据偶联产物最大吸收峰的位移判断是否偶联成功。 1.5 人工合成抗原偶联率的计算 紫外扫描结果显示，蛋白载体最大吸收峰的位置在280 nm，mTP最大吸收峰在261 nm，偶联产物这两个波长的紫外吸收强度包括了蛋白载体和mTP的贡献。人工合成抗原的摩尔偶联率CmTP/CBSA可由以下公式计算得出： CmTP/CBSA=(A280×KBSA，261－A261×KBSA，280)/(A261×KmTP，280－A280×KmTP，261) 其中A280、A261分别为偶联产物在波长为280 nm和261 nm时的紫外吸光度，KBSA，280、KBSA，261、KmTP，280、KmTP，261分别对应BSA和mTP在波长为280 nm和261 nm的摩尔消光系数［3］。 1.6 TP人工抗原多抗血清的制备及鉴定 初次免疫：将100 μg 人工抗原与等体积FCA乳化完全，皮下分点注射4只BALB/c小鼠；2次免疫：初次免疫后两周将100 μg 人工抗原与等体积FIA乳化完全，皮下分点注射BALB/c小鼠；3次免疫：两周后将150 μg 人工抗原皮下分点注射BALB/c小鼠；第3次免疫两周后，以200 μg人工抗原经腹腔加强免疫血清效价较高的小鼠。尾部采血分离抗血清，以制备的检测抗原OVA mTP包被ELISA板，采用间接ELISA法检测血清抗体的效价。为了验证血清中TP抗体的特异性反应，我们用偶联好的OVA mTP包被酶标板，再用不同浓度的TP、雷公藤内酯三醇（图3）和冬凌草甲素（oridonin）间接竞争ELISA法检测血清中抗体特异性。以TP为例，竞争ELISA方法如下：取OVA mTP于37 ℃，2 h包被酶标板（每孔100 μl），10 %羊血清封闭后PBST洗3次，每孔加入50 μl TP，浓度分别为1、2、5、8、10、30、50 ng·μl－1和50 μl稀释的血清，混匀后37 ℃反应1 h，PBST洗3次，加入酶标二抗37 ℃反应1 h，洗3次，每孔加显色液150 μl，反应15 min，2 mol·L－1硫酸终止反应后，用酶标仪测450 nm吸收值，每孔测4次，取平均值，建立竞争抑制曲线。 2 结果和讨论 2.1 mTP的质谱鉴定 mTP质谱如图4，相对分子质量为440和540的峰分别对应TP和mTP各自与溶剂吡啶形成的离子 图3 雷公藤内酯三醇结构 Fig 3 Triptriolide structure峰。虽然产物mTP中还含有一部分反应原料TP，但是TP无法与蛋白载体在EDC存在条件下进行缩合反应，因此这部分TP并不会对人工抗原的合成造成干扰，我们无需对mTP进行提纯以除去TP。 2.2 TP人工抗原的紫外鉴定和偶联率 阳离子化的牛血清白蛋白载体cBSA的氨基数量远多于羧基，一方面能够提高偶联效率，另一方面提高了BSA的等电点，使得蛋白在反应体系的pH下溶解度大大改善。偶联产物的紫外光谱见图5，偶联产物的最大吸收峰相比蛋白载体向左明显偏移，由280 nm到了269 nm左右，显示偶联成功。偶联产物在280 nm和261 nm的紫外吸光值分别是3.029和3.058，由公式可计算得出mTP和蛋白载体cBSA的摩尔比为65∶1，偶联效率较高。 2.3 多抗血清的效价和抗体特异性反应 第3次免疫两周后，用间接ELISA法测定小鼠血清抗体效价为1∶102 400，TP、雷公藤内酯三醇和冬凌草甲素的间接竞争ELISA实验表明，TP及其衍生物雷公藤内酯三醇均能产生竞争作用，而冬凌草甲素不显示竞争关系，证明血清中多抗能在很大程度上与TP及其衍生物雷公藤内酯三醇反应，而完全不能与同为二萜类化合物的冬凌草甲素结合。与TP相比，雷公藤内酯三醇仅仅是12，13位的环氧基团打开，其它结构完全一致，能被多抗识别是可以理解的，但从竞争曲线上看来，TP的竞争饱和吸光值要低于雷公藤内酯三醇，从一定程度上证明多抗与TP的结合能力强于雷公藤内酯三醇，提示多抗中存在着识别TP 12，13位环氧基团的特异性抗体。冬凌草甲素是一种中药提取物，也具有抗肿瘤、消炎止痛等功效，与TP同为二萜类化合物，具有类似的相对分子质量，分子为四环结构，无环氧内酯，不能产生竞争作用，证明多抗对TP系列分子结构的特异性识别。以浓度为横坐标、OD450值为纵坐标，竞争抑制曲线如图6所示。 从TP的竞争抑制曲线上看，在0～8 ng·μl－1的浓度区间内，OD450和TP的浓度呈一定的线性关系，暗示可以通过ELISA方法进行TP的定量。现有的TP HPLC定量法灵敏度和重复性很好，可是设备昂贵，样品预处理麻烦，检测定量成本高［4］。与之相比，ELISA定量更加方便高效，可以批量处理样品，节约成本，在灵敏度上也绝对满足要求。ELISA定量检测TP是个很有前景的方法。 TP在抗炎、免疫抑制等方面的功用早已得到证实，杨远等［5］发现TP抑制哮喘患者外周血单核细胞中IL 4在mRNA水平的表达，其在抗肿瘤方面的活性也有很多研究报道。近年来，通过对TP结构修饰研究其分子结构和基团对生物活性的影响已经取得了一定的进展。从TP的分子结构来看，它含有3个环氧基团和1个五元不饱和内酯环，这些基团在一定条件下将会发生反应。其主要功能基团包括14位羟基，（9，11）位、（12，13）位和（7，8）位3个环氧基，（3，4）位双键以及1个内酯环。已有的TP结构 活性研究显示，TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团。从分子模型上看，12，13位环氧空间位阻较另两个环氧基团小，易受亲核试剂攻击，它的存在是TP具有生物活性的主要原因。研究证实，对于12，13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性。此外，通过对雷公藤中一系列与TP结构类似二萜类化合物的初步药理研究表明，2位的氢被羟基所取代，将降低化合物的抗炎、抗肿瘤和免疫抑制活性，但会使抗生育活性和毒性有所增加。而将TP的5位添加一个羟基后形成的衍生物，其具有一定的T细胞增殖和活化抑制作用，但它的毒副作用则降低了122倍（体外实验）和10倍（体内实验），这说明TP 5位的氢与TP对其它组织器官的生物活性密切关联［2］。对TP及其衍生物各种生物活性的分子机理方面，近年来也有越来越多的研究报道，其中对免疫抑制作用的报道主要集中于对各种免疫细胞的影响，TP体外实验证实，其对T细胞及B细胞均有影响，且可明显抑制有丝分裂原刺激的淋巴细胞增生反应，诱导活化的淋巴细胞发生凋亡，同时还通过抑制淋巴细胞NF κB 的活力而减少多种促炎因子(如IL 1，TNF α等) 及细胞因子的产生［6 9］。TP可通过PI3K/Akt以及NF κB途径影响对DC细胞迁移［10］。然而，对于其小分子作用靶点的定位究竟在细胞膜、细胞质还是细胞核中，其作用的靶蛋白究竟有哪些，TP是如何通过其靶蛋白发挥生物活性等的分子机制研究尚处于探讨之中。Stephanie等[11]通过3H标记TP，发现TP与细胞的结合是可饱和、可逆的并且大部分结合在细胞膜上，且3H标记的TP只能与完整的细胞结合，而不能与细胞裂解液的任何一个组分结合。Christine及其同事［12］也通过类似的研究发现TP与细胞核成分结合，可特异性、不可逆地与单核细胞和上皮细胞中一个90 kD的核抽提蛋白结合。所以，TP的作用方式到底是怎样的？其靶点究竟有那些？以上这两个互为矛盾的研究结果并不能对此给出明确的答案。通过制备TP的抗体，就可以提供一个有效的手段和工具通过免疫荧光方法研究确定TP在细胞内的定位，通过激光共聚焦荧光显微镜观察其在细胞内作用过程，也为通过免疫共沉淀等方法寻找TP的分子靶点，以揭示其分子机理创造条件。 另外，本研究中TP多克隆抗体的成功制备也为我们进一步制备其单克隆抗体奠定了基础。与多克隆抗体相比，单克隆抗体对于进行TP作用机制方面的研究具有更多的优点，并且单克隆抗体也可以为TP提供新的定量方法，甚至为研究其在体内的代谢和分布创造条件。本研究通过选择TP的14位羟基作为反应基团，先用丁二酸酐将羟基修饰为羧基，然后和cBSA、OVA偶联，偶联率达到了65∶1。借此方法，本研究成功制备了多克隆抗体，制备的多抗血清效价达到了106以上，竞争ELISA曲线表明此多抗对TP家族分子有特异性反应，且TP与雷公藤内酯三醇的竞争曲线不尽相同。以上结果暗示，我们通过制备其单克隆抗体，不仅可以筛选到识别TP家族的单克隆抗体，还有可能进一步筛选到能够特异性区分TP与雷公藤内酯三醇的单克隆抗体，为雷公藤单体作用机理及其定量分析研究创造条件。

Ⅶ 如何检测t细胞受抗原刺激后产生的il 2

抗原不是直接刺激T细胞的.比如说,病毒作为抗原可以是感染细胞后,宿主细胞内会有部分分解的抗原肽,然后被细胞的MHC分子呈递到细胞表面,这种MHC-1与抗原肽的复合体可以与T细胞（比如CD8T细胞,细胞表面表达CD8的T细胞,T细胞分为很多种）表面的识别分子结合,这就刺激了T细胞.再比如说细菌侵入,被巨噬细胞吞噬以后,细菌中的抗原肽也会被巨噬细胞的MHC-II呈递到细胞表面,然后CD4T细胞（细胞表面表达CD4的T细胞）就能识别它,就刺激了T细胞.
总之,细胞与细胞之间的相互作用,多数都是细胞表面各类受体蛋白之间的相互作用.

（另：MHC分子可以把细胞内所有降解的肽类递呈到细胞表面,不仅仅是抗原肽,但是细胞在免疫初期,能够识别自身表达的免疫细胞都死了,最后剩下的,都是不能识别自身蛋白的免疫细胞（这叫免疫耐受）.然后,当外界有东西入侵的时候,这些非自身的抗原肽被递呈到细胞表面,就会被免疫细胞识别.）

Ⅷ 免疫学的检测方法

免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫。

Ⅸ T淋巴细胞的免疫检测

T细胞分化抗原测定
【中文名称】
T细胞分化抗原测定
【概述】
T细胞膜表面有100多种特异性抗原，现已制备了多种单克隆抗体，WHO（1986）统称为白细胞分化抗原（cluster differentiation，CD）。例如CD3代表总T细胞，CD4代表T辅助细胞（TH），CD8代表T细胞毒性细胞（TC）等。应用这些细胞的单克隆抗体与T细胞表面抗原结合后，再与荧光标记二抗（兔或羊抗鼠IgG）反应，在荧光显微镜下或流式细胞仪中计数CD的百分率。
【参考值】
免疫荧光法（IFA）：CD3为63.1%±10.8%；CD4（TH）为42.8%±9.5%；CD8（TS）为19.6%±5.9%；CD4/CD8（TH/TS）为（2.2±0.7）/1。流式细胞术：CD3为61%～85%；CD4为28%～58%；CD8为19%～48%；CD4/CD8为0.9～2.0/1。
【临床意义】
①CD3降低：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎等。
②CD4降低：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者。
③CD8减低：见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病。
④CD4/CD8比值增高：见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒性感染、变态反应等；CD4/CD8比值减低：见于艾滋病（常<0.5）。
⑤监测器官移植排斥反应时CD4/CD8比值增高预示可能发生排斥反应。
⑥CD3、CD4、CD8较高且有CD1、CD2、CD5、CD7增高则可能为T细胞型急性淋巴细胞白血病。

Ⅹ 细胞免疫功能检测常用有哪几种方法

细胞免疫（CMⅠ）是由多种细胞相互作用的结果。免疫细胞间相互作用导致多种细胞因子的释放。因此细胞功能测定不仅涉及T细胞的数量和功能与包括各类因子活性测定，因此评价机体的细胞免疫功能不仅程序复杂，且很难标准化。
一、迟发型过敏反应的体外检测方法
皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。
1．皮肤试验 用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24～48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。
2．接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱生接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导至DTH反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7～10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。
二、细胞免疫的体外检测方法
体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%，B细胞占4%～10%，其作为非DT、非B细胞。
1．T细胞计数
（1）E花环法：人类T细胞表面有SRBC受体（CD2）能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，将经分层液分离现的RBM悬液与SRBC在含有血清的平衡盐水中混合，经37℃培养5～10分钟放4℃过夜，取细胞悬计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞。目前此方法已用来分离T细胞，而不用做T细胞计数。
（2）用单克隆抗体计数T细胞：将人的PBM分成三等份，分别用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作第一抗体与细胞结合，再用FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体作第二抗体进行间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下或流式细胞仪检测结果，在PBM中被CD3抗体染上荧光的细胞称为CD3 细胞即总T细胞。正常人在PBM中T细胞占70%～80%。正常人的CD4 细胞和CD8 细胞之和应与CD3 细胞数一致。CD4 细胞与CD8 细胞的比值正常人约为2/1而艾滋病患者则比值小于1.7。
2．T细胞活化试验 T细胞能被非特异的物质称为有丝分裂原所激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最图导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪检查掺入正在分裂的淋巴细胞，用液测量仪检查掺入的3H-TdR的多少确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法，MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲（fromazan）产物。该产物的多少与活性细胞数正相关。结果可用酶标检测仪（595mm）测量汇丰银行密度，做为MTT法的检查指标。此法的结果与3H-TdR掺入法平行，并能反应试验中的活细胞数。
3．细胞毒试验 TC细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。常用的栓测细胞毒效应的方法是51Cr-Na2Cro4盐水溶液与靶细胞胞混合，于37℃培养1小时左右，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待检细胞毒性的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50：1或100：1）靶细胞被杀伤越多，释放到上清液中的液游离的51Cr越多，且不能被其他细胞吸收。用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。
细胞毒试验检测Tc细胞效应功能是否健全，及经IgG介导的ADCC效应，或NK细胞在抗肿瘤免疫中的作用是有意义的。
4．混合淋巴细胞的反应（MIR） 是体外研究T细胞的较好的方法，双向MLR常被用来筛选骨髓移植的供体。来自不同供体的淋巴细胞分别与病人的淋巴细胞混合培养4～5天，在最后8小时掺入51TdR掺入法测T细胞的反应性。或用细胞毒法观察受刺激的T细胞与活的靶细胞混合（靶细胞来自与刺激细胞相同的个体）如果T细胞受刺激后产生了细胞毒T细胞，可杀死活的细胞，根据靶细胞释放51Cr的多少算出T细胞移动抑制因子）和LIF（白细胞移动抑制因子）来评估细胞免疫功能。近年来应用测定IL-2的免疫酶技术，操作简单，并能定量以取代了MIF和LIF的测定。单个核细胞与分裂原一起培养24小时，然后测定清液中的IL-2活性。在细胞免疫功能缺损时，特别是AIDS病人，IL-2分泌明显降低。而有些疾病，如多发性硬化、类风湿关节炎、移植排斥反应等病人体内血清中IL-2水平升高，表明病人T细胞活性增高。发生移植排斥反应的病人尿中IL-2也可升高。
也可用酶联免疫吸附试验测定各种体液中活化的T细胞脱落的IL-2受体（CD25），一般来说IL-2的水平和IL-2受体水平是平行的，IL-2和IL-2受体的检测可用于对某些疾病的监测，如移杆排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治疗的病人。
对体外培养的细胞进行细胞因子产生能力检测是检查细胞培养上清液中细胞因子的生物活性或抗原性。现已可用核酸杂交技术，即从组织中或细胞中提取RNA，与同位素或酶标记的该种细胞因子的cDNA探针作分子杂交试验，即印迹（dot blotting）或Northern印迹，若查出有某种因子的mRNA存在，即说明该细胞在所处培养条件下有产生某种细胞因子的能力。