糖结构分析方法

① 植物组织中糖的测定方法有很多种,举例说明他们的原理和优缺点

有许多不同的分析技术用于糖的分离和测定,包括化学分析、比色分析、纸色谱、薄层色谱、气相色谱和高效液相色谱等。本文总结了近十年植物组织中糖类化合物的研究进展，为其含量测定提供理论依据。

1 分光光度分析法

分光光度法是基于长链多糖在水溶液中离解后可与染料等阳离子相互结合发生反应，从而引起染料吸收光谱的变化进行测定。这种方法具有较好的选择性，可以用于实际样品的测定，通常有两种常见方法。

1.1 蒽酮 - 硫酸比色法

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为 630 nm，可在此波长下进行比色。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖和己糖而且可以测寡糖和多糖，在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量。蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，但测定结果误差较大，只能测定样品中可溶性糖总量。陈鸿英等人用蒽酮硫酸法测定淫羊藿多糖的含量，得到的结果较稳定。

1.2 苯酚 - 硫酸比色法

植物体内的糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定糖的原理是在浓硫酸作用下，糖脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10mg～100 mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485 nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定 160 min 以上。

2 气相色谱法

气相色谱法是以气体作为流动相的一种色谱分析方法气相色谱法测定糖类，具有选择性好、样品用量少、分辨率高、快速准确、灵敏等优点。曾昭睿采用三 - 端烯丙基 - 不对称二苯并 14- 冠 - 4- 二羟基冠醚做固定相分离了鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的乙酸酯衍生物。吴建元等人利用气相色谱法分析茯苓多糖的单糖组成结果 6 种标准单糖的衍生物实现了良好的分离并具有良好的峰形。胡磊等人用 1 一甲基咪唑为溶剂和催化剂、盐酸羟胺和乙酸酐为肟化和乙酰化试剂，对植物样品中糖与糖醇进行乙酰化衍生化利用气相色谱分离和质谱鉴定的分析方法。

3 高效毛细管电泳法

除了少数带有羧基和磺酸基的糖类化合物，绝大多数糖类化合物不带电荷，极性很大且没有发色基团。所以用一般的高效毛细管电泳系统无法得到分离和检测。为了使糖类化合物能产生电迁移而得以相互分离，可采用的方法有：（1）衍生化使之带上发色、荧光基团或电荷；（2）与硼酸盐等络合；（3）与缓冲液中的添加剂形成包合配合物；（4）高 pH缓冲条件下使之电离；（5）加入表面活性剂使形成胶束。20世纪 90 年代以来毛细管电泳因具备分离快速，所需样品量少和自动化程度高的特点，已广泛应用于糖化合物的分析。

4 高效液相色谱法

HPLC 用于糖的定性和定量分析具有快速、灵敏、样品处理简单等优点。从大量的文献报道和综述中可以看出，由于糖的特殊结构及它本身不含强紫外和荧光吸收的官能团，到目前为止还没有建立一个统一的方法来分析所有的单糖和低聚糖。分析糖的色谱柱有化合键合烷基柱、阴阳离子交换柱、氨基键合硅胶柱和硅胶柱等。

文献来源：孙艳涛，由欣. 植物组织中糖化合物测定方法的研究进展.科教文汇(上旬刊). 2011,10(上旬刊) ：134-135.网页链接

② 糖链分析有哪些常规方法和步骤

蛋白质糖基化是人体中最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,人体中超过50%的蛋白质是糖基化的。研究发现,寡糖在蛋白质结构构造、生物活性中起着至关重要的作用,人类许多疾病的发生和发展都与蛋白上N-糖链的结构和表达量的改变有关。因此,发展和建立分析N-糖链的方法,对生物和病理学研究具有积极现实意义。目前的研究方法主要是化学衍生法,其缺点是需要引入额外的化学试剂、操作步骤繁琐以及有副反应发生。化学酶标记法由于没有化学衍生法的特点,为研究糖蛋白中的N-糖链,提供了新的思路。首先,在本实验室前人工作的基础上,以Boc-Asn-GlcNAc为基础结构单元物质合成了同位素标记糖基受体d0/d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc,优化了受体合成方法：以DMT-MM作为反应缩合剂,探索温度、时间、反应物比例对受体产率的影响,合成受体反应产率达到95-98%。随后,我们以标准糖肽SGP为反应底物,对比Endo-M酶、(?)Endo-M-N175Q酶的转糖基活性和水解活性,结果表明Endo-M-N175Q酶的转糖基活性几乎是Endo-M酶的2倍,且Endo-M-N175Q酶几乎丧失对转糖基产物的水解能力。紧接着我们以标准糖蛋白牛胰核糖核酸酶B为研究对象,对比丙酮富集N-糖链和N-糖苷酶F释放N-糖链两种方法检测糖链的效率,结果表明N-糖苷酶F释放N-糖链简便、高效。为了检验该方法的实用性,我们以卵清蛋白为实际样品,成功、高效地检测出一系列N-糖链(M5N2、M6N2、M7N2、M4N3、M5N3、M3N4、 M3N5、M4N4、M3N6),和文献己报到的寡糖数量一致,正离子模式下这些寡糖都是以二价或三价的形式出现。相比于传统的化学衍生化法,Endo-M-N175Q酶可以一步完成酶解和转移两个过程,避免了繁琐的步骤以及副反应的发生。因此,我们提出的以含有Boc-Asn-G1cNAc结构单元的化学物质作为糖基受体、结合Endo-M-N-175Q酶的特性、以HPLC/ESI-MS为检测手段,这一全新的分析方法,对分析糖蛋白中的N-糖链切实高效可行。…

③ 测定糖类的主要方法有哪些

4种糖的测定方法
总结：
1、 直接滴定法。
原理为 糖还原天蓝色的氢氧化铜为红色的氧化亚铜。缺点：水样中的还原性物质能对糖的测定造成影响。
2、 高锰酸钾滴定法。
所用原理同直接滴定法。缺点：水样中的还原性物质能对糖的测定造成影响，过程较为复杂，误差大。
3、硫酸苯酚法。
糖在浓硫酸作用下，脱水形成的糠醛和羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。
缺点：如果水样呈橙红色（大部分水样为黄色），会对比色法造成较大的干扰。
4、蒽酮法
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛和羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的测定。
缺点：，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅。
综合比较；采用蒽酮法能将最为准确地测定尾水中糖的含量。

④ 请教关于糖基化程度的分析方法

糖基化程度的分析过程大致如下：首先是鉴定糖蛋白，即确定糖蛋白的存在；其次是富集糖蛋白，即糖蛋白的分离存化。

糖蛋白的检测大致有以下几种：放射性标记法、分子荧光标记法、电泳法、凝集素标记法、抗体标记法和化学酵素法。

获得糖基化蛋白的方法主要是电泳法和层析法。电泳法即通过电泳的方法先得到糖蛋白条带或蛋白点，再通过电洗脱或透析的方法得到糖蛋白。此方法较为费时，且在操作中易使蛋白变性。而层析法则具有快速、准确、分辨率高、稳定性好等特点，是分析糖蛋白的理想手段。目前，利用抗体、凝集素进行亲和层析已成为分离存化糖蛋白的主要方法。

糖基化氨基酸位点的鉴定中，Edman降解法冗长，需要高超的实验技巧和较多的蛋白质，且无法处理N－端封闭的蛋白质。因此，随着质谱技术的发展，此法已不在被广泛使用。核磁共振技术也可用于糖基化氨基酸位点的鉴定。这种方法可在液态溶液中直接进行蛋白质结构测定。糖链结构的鉴定也采用质谱技术、毛细管电泳技术、气相色谱技术及凝集素亲和技术。

⑤ 苷中糖的鉴定方法

结构鉴定 1糖的种类和比例 一般是将其苷键全部水解，然后再用纸色谱或薄层色谱的方法检出糖的种类，经显色后用薄层扫描的方法测定出各糖之间的分子比。当然也可采用气相色谱或HPLC的方法对各单糖进行定性定量分析。 2糖与苷元的连接位置 糖连接位置的测定多是将被测物全甲基化，然后水解所有的苷键，用气相色谱的方法对水解产物进行定性定量分析。通常具有游离羟基的部位即是糖的连接位点。目前多用苷化位移来确定。糖的端基羟基成苷后，端基碳（C1）和苷元的α-C的化学位移均向低场移动，而相邻的碳（β-C）稍向高场移动，偶尔也有稍向低场移动的，这种苷化前后的化学位移变化，称做苷化位移。 3糖的连接顺序及位置 早期解决糖链连接顺序的方法主要是部分水解法，即稀酸水解、甲醇解、乙酰解、碱水解等方法，将糖链水解成较小的片段（各种低聚糖），然后根据水解所得的低聚糖推断整个糖链的结构；质谱分析是解决低聚糖及其苷中糖连接顺序的一个有力工具，在了解了糖的组成后，可根据质谱中的裂解规律和该化合物的裂解碎片推测低聚糖及其苷中糖链的连接顺序；现在测定糖链结构最常用的方法是NMR和2D-NMR法。