elisa检测细胞的方法与步骤

1. ELISA检测试剂盒的基本操作步骤有哪些

ELISA检测试剂盒的基本操作步骤可分为以下核心环节，每个步骤均需严格遵循规范以确保检测准确性：

一、试剂与样本准备

• 样本处理

• 血清/血浆：血液需室温静置2小时或4℃过夜析出血清，30分钟内离心（血清2000×g 20分钟，血浆1000×g 15分钟），分装后-20℃/-80℃保存，避免反复冻融。

• 细胞培养上清/裂解液：离心去除细胞碎片，裂解液需超声或反复冻融破碎细胞后取上清。

• 组织匀浆：预冷PBS冲洗组织，机械匀浆后离心取上清。

• 注意事项：避免使用NaN₃（抑制HRP活性），溶血样本需弃用。

• 试剂平衡
  所有试剂需提前30分钟恢复至室温（约25℃），避免温度差异影响反应速率。

、实验核心步骤

1. 包被与封闭（若试剂盒未预包被）

• 包被：将抗原/抗体以5μg/ml浓度溶于碳酸盐缓冲液（pH 9.6），加入酶标板孔（100μL/孔），4℃过夜或37℃孵育2小时。

• 封闭：加入含1% BSA或5%脱脂奶粉的封闭液（200μL/孔），37℃孵育1小时，防止非特异性吸附。

2. 加样与孵育

• 加样规范：

• 使用校准后的微量加样器，45°角贴壁加入样本/标准品（50-100μL/孔），避免气泡或液体溅出。

• 样本需按梯度稀释，复孔加样量≥100μL/指标，每加一种试剂需更换吸头防止交叉污染。

• 孵育条件：

• 温度：通常为37℃，多板操作时避免叠加放置以减少边缘效应。

• 时间：一抗孵育1-2小时，二抗孵育30-60分钟，具体依试剂盒说明调整。

3. 洗涤

• 方法：甩去孔内液体后，注入洗涤液（PBST或含Tween-20的缓冲液）至满孔，浸泡30秒后拍干，重复3-5次。

• 关键点：洗涤不彻底会导致高背景，过度洗涤可能损失结合物，需平衡次数与强度。

4. 酶标抗体结合

加入HRP或AP标记的二抗（100μL/孔），37℃孵育30-60分钟，再次洗涤去除未结合酶标物。

5. 显色反应

• 底物选择：HRP常用TMB（显蓝色），AP常用PNPP（显黄色），避光条件下加入（100μL/孔）。

• 显色控制：室温避光反应10-30分钟，密切观察标准孔梯度，显色过深时提前终止。

6. 终止反应

每孔加入50μL终止液（如2M H₂SO₄），立即摇匀使颜色稳定（蓝色转黄色），15分钟内完成读数。

三、结果分析

• 读数：使用酶标仪在450nm（TMB）或405nm（PNPP）波长读取OD值，双波长检测可减少孔间干扰。

• 标准曲线绘制：以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标，采用四参数逻辑（4PL）模型拟合曲线。

• 浓度计算：样本OD值代入标准曲线方程，乘以稀释倍数获得实际浓度。若OD值超出线性范围，需调整样本稀释度复测。

  四、常见问题与优化策略

• 

  请点击输入图片描

  五、关键注意事项

• 全程防污染：使用无菌耗材，操作台定期消毒，避免样本间交叉污染。

• 温度一致性：孵育时使用预热的湿盒或恒温摇床，减少孔间温差。

• 设备校准：酶标仪每年校准一次，移液器每月验证精度。

• 数据记录：详细记录试剂批号、操作时间及环境温湿度，便于追溯异常结果。

通过上述步骤的精细化控制，可显着提高ELISA检测的重复性与准确性，满足临床诊断与科研需求。实际操作中需以试剂盒说明书为准，结合预实验优化条件。