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淋巴細胞分離純度的檢測方法

發布時間:2024-06-14 20:26:21

A. 免疫細胞分類及分離方法是什麼

免疫細胞(immune cell)主要是指能識別抗原,產生特異性免疫應答的淋巴細胞等。淋巴細胞是免疫系統的基本成分,在體內分布很廣泛泛,主要是T、B淋巴細胞受抗原刺激而被活化(activation),分裂增殖、發生特異性免疫應答。除T淋巴細胞和B淋巴細胞外,還有K淋巴細胞和NK淋巴細胞,共四種類型。T淋巴細胞是一個多功能的細胞群。除淋巴細胞外,參與免疫應答的細胞還有漿細胞、粒細胞、肥大細胞、抗原呈遞細胞及單該吞噬細胞系統的細胞。免疫細胞分離技術
1、淋巴細胞的分離
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀釋後,沿管壁徐徐滴流疊加盛有2m1 淋巴細胞分離液的試管內(注意勿與分離液混合,然後2000r/min 水平離心20min,管內分為4 層,自上而下依次為血漿,單個核細胞,顆粒白細胞、紅細胞(圖2—1)。用毛細管伸至單個核細胞層中(位於細胞分離液與血漿的界面上),沿管壁輕輕吸出全部細胞。然後用Hanks 液洗兩次,每次2000r/min 離心10min,最後用RPMI l640 培養液將細胞配成2×106/m1 的細胞懸液備用。
2、T 細胞及B 細胞的分離
將淋巴細胞懸液通過尼龍棉柱,B 細胞粘附於尼龍棉上,T細胞則不粘附,先用RPMI l640 培基洗脫尼龍棉柱,流下的細胞懸液含有豐富的T 細胞。然後用力反復擠壓尼龍柱、擠出粘附在尼龍棉上的B 細胞,並用少量的RPMI l640 培基洗脫,此細胞懸液含有豐富的B 細胞。尼龍柱(塑料管)的長短和尼龍棉的多少,視分離細胞的多少而定。

3、CD4 細胞及CD8 細胞的分離
(1)CD4 細胞的分離:將一定量的T 細胞懸液通過一根SephDdexC—10 柱,然後用少量的RPMll640 培養洗滌,收獲的細胞懸液約含85%的CD4 細胞。
(2)CD8 細胞分離:用Tris 緩沖液稀釋羊抗鼠IgG(濃度為10μg/m1)包被一平皿表面,然後放置4℃過夜,沒有包被上的抗體用PBS 洗凈。然後將已標記有抗CD8 單克隆抗體的T 細胞(細胞濃度為1×l07/m1)3m1 加入上述的平皿內,4℃放置2 小時,用PBS 輕輕洗凈末粘附的細胞,然後用毛細管加入10m1 PBS 吹打。收集的脫落細胞經洗滌後懸浮在RPMI l640 培基中備用。CD4 細胞亦可用此法分離。
4、單核巨噬細胞的分離
單核巨噬細胞有粘附塑料或玻璃表面的特性,而淋巴細胞則無此特性,藉此可將這兩類細胞分開,其方法簡述如下。將待分離的細胞懸液(如實物動物的腹腔液)加入適當大小的塑料或玻璃平皿內,置於37℃ C02 溫箱內溫育1 小時,然後用RPMI 1640 培基輕輕漂洗平皿表面,去除非粘附細胞,再將粘附有細胞的平皿表面用上述培基輕輕洗刷,收集粘附的單核巨噬細胞。如果要獲得純度較高的單核巨噬細胞,可重復上述過程。

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C. 求人外周血B、T淋巴細胞的分離方法

目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞。
方法:
1.在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。
2.取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻,用滴管沿管壁緩慢疊加於分層液面上,注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鍾。
3.離心後管內分為三層,上層為血漿和Hank's液,下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液,在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色雲霧層狹窄帶(如下圖),單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外,還含有血小板。

4.用毛細血管插到雲霧層,吸取單個核細胞。置入另一短中管中,加入5倍以上體積的Hank's液或RPMI1640,1500rpm×10分鍾,洗滌細胞兩次。
5.末次離心後,棄上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2%台盼蘭染液混合,於血球計數板上,計數四個大方格內的細胞總數。
單個核細胞濃度(細胞數/1毫升細胞懸液)=
4個大方格內細胞總數
──────────×104×2(稀釋倍數)
4
6.細胞活力檢測:死的細胞可被染成蘭色,活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。
活細胞數
活細胞百分率=──────×100%
總細胞數
用本法分離PBMC,純度在90%以上,收獲率可達80~90%,活細胞百分率在95%以上。

D. 浜哄栧懆琛娣嬪反緇嗚優鍒嗚備腑鏈熺粏鑳炲埗鐗囧悗鏄懼井闀滀笅瑙傚療鏃朵粈涔堟牱瀛

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E. 請教:小鼠單個核細胞分離及Ficoll

單核細胞(monocytes)是體積最大的白細胞.其細胞核常偏位,呈多形性,如卵圓形、腎形、馬蹄形、不規則形等,常有折疊感;染色質呈疏鬆網狀,著色較淺.胞質較多,嗜鹼性,但因含大量細小的嗜天青顆粒而染成灰藍色,顆粒含過氧化物酶.血塗片,Giemsa染色 .
單個核細胞是指只有一個細胞核的細胞.一般醫學檢驗書上說的是「外周血中單個核的白細胞」包括「淋巴細胞和單核細胞」.外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear
cell,PBMC)即外周血中具有單個核的細胞,包括淋巴細胞和單核細胞.體外檢測淋巴細胞首先要分離外周血單個核細胞,目前主要的分離方法是
Ficoll-hypaque(葡聚糖-泛影葡胺)密度梯度離心法,因為血液中各有形成分的比重存在差異,因此得以分離.紅細胞和
粒細胞密度大於分層液,同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積於管底.血小板則因密度小而懸浮於血漿中,唯有與分層液密度相當的單個核細胞密
集在血漿層和分層液的界面中,呈白膜狀,吸取該層細胞遞經洗滌高心重懸.本法分離單個核細胞純度可達95%,淋巴細胞約佔90%~95%,細胞獲得率可達
80%以上,其高低與室溫有關,超過25℃時會影響細胞獲得率.

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