轉錄後調控的研究方法

❶ 如何研究一個轉錄因子對目的基因的調控

1.雙熒光報告實驗! 2.敲低轉錄因子基因,靶基因表達下調! 3.設計轉錄因子結合區突變體, Gel-shifting實驗!

❷ 植物轉錄因子調控網路該怎麼研究

我們以玉米為例，介紹構建TF調控網路的詳細方法。

真核細胞內的轉錄調控網路，是由 轉錄因子（TFs）的組合作用所決定的 。但是， 植物中的TF結合研究的數量太少 ，無法給出這個復雜網路的全貌。

本研究 以玉米為模型，對玉米葉片中表達的104種TF進行ChIP-seq，重建其轉錄調控網路 ，並訓練機器學習模型來預測TF結合和共定位。

作者開發了一種高效的玉米原生質體分離和轉化系統（圖1a），成功 對104個在玉米葉片發育切片上表達的TFs進行了ChIP-seq實驗 。然後應用 ENCODE2統一pipeline來處理 ，總共得到了217個ChIP-seq數據，2,147,346個可重復的TF結合peak。

驗證發現， TF結合形成密集的cluster並定位在開放的染色質區域 （圖1b-d）。使用 GO-term和MAPMAN功能類別富集分析 ，來根據靶基因對其進行分類（圖1e）。 大部分的TFs被分為信號傳導、激素、光合作用和代謝類 ，這些都是葉子的核心生物功能。

此外，作者觀察到盡管一半以上的TF結合位點位於基因5'的近端區域，但遠側的TF結合位點（如 Vgt1 ）也顯示出相似的染色質特徵，並可能在調節轉錄中發揮重要作用（圖2）。

接下來，使用 ENCODE TIP概率框架 構建了一個基因調控網路，使用該TIP模型，生成了一個具有272,627條邊和20,179個節點的網路圖（約45％的注釋基因和約77％的葉子表達基因）（圖3a）。

生物網路通常表現出拓撲和/或功能模塊化。應用分區演算法（Gephi version 0.92）來確定網路元素子集之間的關系，發現網路可以被劃分為七個模塊（解析度1.0）。每個模塊包含約27 - 5%的節點。這些模塊並不是孤立的，大約40%的邊緣出現在每個模塊內，說明TFs可以調節自身模塊外的基因，模塊之間存在大量的信息流。接下來，對每個模塊中的基因進行GOterm和MapMan功能富集分析，發現它們確實針對特定功能富集。

然而，每個模塊包含數千個具有不同功能的基因，而且太大而不能作為一個整體進行評估。 假設：由於該網路已經能夠在這個尺度上提供生物學功能的線索，因此可以根據局部規模的連通性來確定更小通路的潛在調控因子 。

首先， 在保守的葉綠素生物合成通路中測試了這一點 。已知該通路受GLK TFs的調控，因為它們的突變會破壞光合作用基因的表達。為了推斷每個TF對給定通路的貢獻， 用ENCODE TIP概率模型為每個TFtarget相互作用計算了對數轉換後的p值的總和 （圖4a）。發現，葉綠素生物合成通路的主要轉錄因子確實是 兩個GLKs和一個未知的MYBR26 。盡管尚未在玉米中研究MYBR26的功能，但其擬南芥同源物參與了晝夜節律調節，進一步證實了假設。

接下來， 使用這種策略來檢查缺乏預先定義調控子的玉米C4光合作用通路 。結果表明，**連通性排名前5位的TFs均為constant -

like（COL）TFs**（圖5b，c）。之前其他植物的研究表明，COLs在花期和光周期的調節中發揮著重要作用。純合突變體具有淺綠色和幼苗致死性表型，支持作者的假設，即COL TF對光合作用很重要（圖5d）。

有趣的是，對於在葉肉或束鞘細胞中特異性表達的關鍵C4光合作用基因，作者發現， 它們的基因位點與細胞特異性H3K27me3標記相關 。這表明， 它們不僅受到復雜的TF網路的調控，而且在表觀基因組水平上也受到調控 （圖5e）。

利用來自於共定位模型的規則，在給定背景下作者對每個partner TF的相對重要性進行了評分，以反映peak集的聯合分布（圖6 d）。

為了從模型結果中獲得全局視圖，作者計算了 所有focus-TF的TF的平均RI 。觀察到，整個集合顯示出一個平均RI值趨於中低（即≤60RI，上下文相關性更高）的趨勢， 較少的TF可以預測大量的focus-TF （即> 60 RI，高組合潛力）。例如，在104個TFs中， LATE ELONGATED HYPOCOTYL （LHY） 在分化葉截面中表達最高。LHY編碼一個MYB TF，它是植物生物鍾中的中心振子，基於RI預測的前三位夥伴TFs是ZIM18、bHLH172和COL7（圖6e）。

盡管它們的功能尚未在玉米中鑒定，但它們的擬南芥同源物分別與茉莉酸信號，鐵穩態和開花時間調節有關，所有這些都與晝夜節律緊密相關。

作者的發現證實， 共結合 可能是解釋具 有相似序列偏好的TF如何靶向不同基因並控制不同生物學功能的關鍵 。共定位模型還揭示了TF結合位點的組合空間很大，這可能有利於特定組合的出現，從而促進了物種形成過程中調控網路的快速多樣化。

接下來，作者研究 禾本科的轉錄調控網路是如何進化的 。作者在 高粱和水稻中進行了ATAC-seq ，並獲得了 其同系玉米基因的開放染色質序列 。然後， 根據玉米TF的模型是否可以預測高粱和水稻中共同目標基因的開放染色質中的結合 ，來推斷網路邊緣保守性（圖7a）。例如，作者在高粱中68％的同系開放染色質區域中發現了預測的TF結合事件。從同系TF到同系基因的預測網路邊緣來看，作者推斷玉米網路中約28％的邊緣在高粱中是保守的，而約19％在水稻中是保守的（圖7b）。

為了在植物中測試同源TF識別位點之間的強相關性，作者計算了玉米，高粱和水稻的開放染色質區域中每個TF模型的匹配數，發現它們確實相關（圖7d）。此外，每個玉米TF在水稻和高粱中發現的保守靶點數量也存在相關性（圖7e），表明在動植物進化過程中存在相似的選擇壓力。

❸ 轉錄因子實驗研究方法有哪些

1.什麼是轉錄因子

轉錄因子（Transcription factor，TF）的調控決定著基因的調控網路以及表達水平。基因的表達驅動著一系列的細胞活動，這些表達的調控需要通過轉錄因子（蛋白）和轉錄因子結合位點（DNA元件）的相互作用實現。轉錄水平的調控不是一個簡單的獨立過程，它是由上百個轉錄因子，目標序列以及共調控因子所組成的高度互作的基因調控網路。

2.為什麼研究轉錄因子

一個課題最開始往往是研究某個基因的序列信息以及基因所行駛的功能作用，這些是屬於基因的下游研究。但在下游研究累積到一定經驗之後，老師往往開始著手於研究基因的上游調控機理，即不單關注基因A如何影響細胞活動，更關注哪些因素影響基因A的功能發揮。調控機理研究理論上會涉及多個層面的因素，例如：轉錄因子、蛋白激酶、miRNA、DNA甲基化、組蛋白修飾、lncRNA……

轉錄因子成為調控機理的研究大戶是最正常不過的事情。因為一個轉錄因子能同時控制多個基因的表達，同時轉錄因子的功能作用也可能受多個共作用因子的影響。如果能闡明如此復雜的調控網路，這可是很有科研成就感的。

3.研究方法

現有主流的轉錄因子鑒別方法可分為兩種：傳統實驗鑒別（experimental methods）以及通過計算機進行的生物信息學鑒別（computational methods）。簡單來說，實驗方法主要用於尋找不同類型目標，即通過已知TF尋找未知TFBS，或通過已知TFBS找出其對應TF。而生物信息學方法更多是用於同類型的預測，即通過序列保守性分析，通過已知TF預測未知TF，或通過已知TFBS預測未知TFBS。這些研究思路的關系如圖1.

圖1. 轉錄因子研究方式

3.1生物信息學預測（computational methods）

無論是TF還是TFBS的同類預測，生物信息的研究手段主要依賴於蛋白質或者DNA的序列保守性進行。具體演算法和軟體有隱馬爾可夫模型,Gibbs抽樣,貪婪演算法等，但這次重點在於介紹研究轉錄因子的實驗方法，因此不過於敘述這部分信息。

3.2實驗方法篩選（experimentalmethods）

實驗方法主要有兩種思路：1. 通過已知TF尋找未知TFBS；2.通過已知TFBS尋找未知TF。無論哪種手段，前提都是基於蛋白與DNA之間的結合關系尋找，即交叉尋找目標，這有別於計算機技術的同類型尋找。

3.2.1通過已知TF尋找未知TFBS

如果已經鎖定了一個感興趣的TF，那常用思路是確定其TFBS，然後得知道它控制的下游基因。從已知TF定位到未知TFBS的過程，主要的實驗方法包括ChIP-seq、DNaseI-seq、DamID-seq等體內實驗，以及DIP-seq、SELEX(-seq)、PBM等體外實驗。

這些研究的通量與應用范圍如圖2所示，其中，縱坐標表示可以從多大范圍檢測TFBS（檢測通量），橫坐標表示TF-TFBS的結合細節（檢測精細程度）。以ChIP-seq為例，它可以在全基因組水平一次發現超過20萬個結合位點信息，但只能確定到TFBS的序列信息（是ATTCG還是ACTCG），卻難以了解到目標TF與TFBS之間的結合程度（TFBS能與TF結合多久，結合多牢固等信息）。

圖2.多種轉錄因子研究方法的比較。 （CS：ConsensusSite，PWM: Position WeightMatrices）

3.2.1.1SELEX技術

Systematicevolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) 是其中最早的一種體外檢測轉錄因子結合位點技術，這項技術在20多年前已被科學家們利用，而且它不需要已知序列信息就可以檢測到新的結合位點。它的原理是（圖3a)：1.提取並純化轉錄因子；2.隨機打斷的DNA文庫與目標轉錄因子孵育；3.提取與TF結合的DNA，進一步PCR擴增片段；4.把PCR擴增的片段重復與TF孵育，最終篩選出高結合率的DNA。SELEX技術不需要已知的DNA片段信息就可以檢測新TFBS，但不足之處在於它只能找出結合率高的TFBS，因此鑒定效率較低。

為了解決鑒定效率較低的問題，高通量測序技術可以聯合SELEX篩選TFBS。關聯高通量技術後，SELEX-seq只需要一輪篩選而不像之前需要多輪篩選，但它的問題在需要大量的高質量純化蛋白以及前期實驗操作復雜。

3.2.1.2Protein-binding Microarrays （PBM）技術

PBM技術（圖3b）首先固定雙鏈dna列陣在晶元當中，然後加入感興趣的目標蛋白，孵育洗脫非結合蛋白後，加入帶有熒游標記的抗體靶向目標蛋白，最後通過熒光信號鑒別蛋白-DNA結合關系。熒光強度會最終換算為PositionWeight Matrices（PWM），從而計算DNA的結合序列。

3.2.1.3DIP-seq

DIP-seq（圖3c）是另外一種體外檢測轉錄因子與dna關系的技術。與PBM不同，這種技術不需要預先固定DNA，它是通過檢測染色質DNA來實現目標鑒定。大體的實驗流程可分為：1.利用甲醛交聯轉錄因子與DNA片段；2.切斷DNA為100到500bp的片段；3.通過轉錄因子特異性抗體，富集與TF結合的DNA；4.去交聯後，富集DNA進行晶元或高通量測序。

3.2.1.4ChIP-seq

ChIP-seq的實驗過程與之間介紹的DIP-seq非常類似，唯一不同是，ChIP-seq可以通過甲醛原位交聯TF與DNA，而DIP-seq只能在體外交聯。ChIP-seq的優點是更高的解析度，更低的噪音等。但它的弊端在於1.過於依賴蛋白數量，2.依賴於交聯效率，3.抗體特異性及獲取可能性。4.難以分辨直接結合還是間接結合的TF。

圖3. 多種主流TF鑒定技術的操作流程

3.2.1.5.mechanically inced trapping of molecular interactions（****MITOMI）

MITOMI是少數可以測量TF與DNA解離系數Kd的實驗技術，它具有中等通量，但卻不適合用於de novo的TFBS鑒定。MITOMI具體流程圖4：

1.將感興趣的tf固定在玻璃上，接通微流管，倒入DNA；

2.DNA結合到固定的tf上；

3.富集結合的DNA，並洗脫未結合的片段；

4.通過富集的DNA數量計算蛋白-DNA解離系數Kd。

圖4. MITOMI原理示意圖

3.2.2.通過已知TFBS尋找未知****TF

比較常見的實驗研究方法是酵母單雜交（Yeast one Hybrid，Y1H）及被稱為反向ChIP實驗 的PICh（Proteomicsof Isolated Chromatin segments）。

3.2.2.1酵母單雜交 （Y1H）

酵母單雜交能篩選到與DNA結合的蛋白質，並可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質的核苷酸序列，而無需復雜的蛋白質分離純化操作，故在蛋白研究中，具有一定的優勢；而且，酵母屬真核細胞，通過酵母系統得到的結果，比其他體外技術獲得的結果，更能體現真核細胞內基因表達調控的真實情況。

主要實驗過程為：

1.把感興趣的TFBS序列（Bait）插入報告基因上游，並將帶有TFBS與報告基因的質粒整合到酵母基因組中，構建含有報告基因的酵母；

2.提取mRNA構建轉錄因子cDNA文庫，並將文庫與酵母激活因子融合相連，構建「Prey」文庫。把帶有文庫的質粒轉入到步驟1的酵母中。

3.條件篩選生長酵母，如果TF與TFBS有結合，即報告基因可以順利表達。

圖5.酵母單雜交技術原理

3.2.2.2PICh實驗

PICh，又被稱為反向ChIP實驗，實際是通過分離的感興趣DNA片段富集轉錄因子，最終利用質譜技術鑒定所富集的蛋白質。PICh所分離的TF難以被識別為直接還是間接結合因子，同時，現階段來說，這項技術的通量相對較低，不適合大批量篩選TF。

注意事項

1.體外實驗雖然可以鑒別很多蛋白-DNA相互作用，但由於生物體復雜性（共調控因子，競爭性轉錄因子等），這些體外識別的相互作用難以在體內重復或發現。

2.體內實驗比較真實地還原轉錄因子-DNA之間的作用，卻難以鑒別出直接還是間接作用關系。

3.利用PBM方法可以完成de novo TFBS鑒別。

4.檢測通量一般受限於蛋白質的純化質量及數量。

5.大多數方法難以分析解離系數，因此對DNA或蛋白質的洗脫難以把握。

6.除了實驗方法，通過計算機技術鑒別結合位點的保守性從而預測新的轉錄因子目標區域已經被大量使用。但無論何種演算法，這些預測都過於簡單化TF-DNA之間的作用關系，從而造成極高的預測假陽性率。

7.(i)ChIP, HT-SELEX, 或PBM方法的目的在於發現結合序列或PWM。 (ii) MITOMI分析可用於進一步分析定量信息。(iii) ChIP實驗可用於分析體內結合信息。

附錄

多種體內外TF鑒定方法的對比：

method：方法；

synomyms：實驗名稱；

throughput：檢測通量；

materialsneeds：所需實驗材料，其中P代表protein，D代表DNA，「＋」到「＋＋＋＋」分別代表數據可用於定性，半定量，定量及動力學分析；

Datatype：實驗所產生的數據類型；

resolution：解析度（可檢測鹼基程度）。

❹ 如何研究基因調控

基因表達的主要過程是基因的轉錄和信使核糖核酸(mRNA）的翻譯。基因調控主要發生在三個水平上，即①DNA水平上的調控、轉錄控制和翻譯控制；②微生物通過基因調控可以改變代謝方式以適應環境的變化，
基因調控
這類基因調控一般是短暫的和可逆的；③多細胞生物的基因調控是細胞分化、形態發生和個體發育的基礎，這類調控一般是長期的，而且往往是不可逆的。基因調控的研究有廣泛的生物學意義，是發生遺傳學和分子遺傳學的重要研究領域。
通過基因調控，微生物可以避免過多地合成氨基酸、核苷酸之類物質。如果使它們的調節基因發生突變，就可以得到大量合成這些物質的菌種，把這些菌種用在發酵工業上，使產量大幅度增長。在遺傳工程的研究中應用基因調控的原理可使外源基因表達(見重組DNA技術），所以基因調控的理論探討還具有生產實踐意義

❺ 轉錄因子相關調控研究案例（二）

本期解讀文獻 內容「 在含氧量正常的情況下，三陰乳腺癌的LncRNA LINK-A激活HIF1α信號通路 」

LncRNA LINK-A在細胞質中與蛋白BRK、LRRK2結合，當有胞外因子刺激時，LINK-A與蛋白復合物接收EGFR/GPNMB信號然後與轉錄因子HIF1結合，BRK將HIF1的Tyr 565磷酸化，LRRK2將HIF1的Ser 797磷酸化，HIF1磷酸化後進入細胞核與P300共同作用於癌相關基因的啟動子促進基因轉錄表達。

作者首先通過檢測三陰乳腺癌細胞和正常細胞的LINK-A表達驗證在三陰乳腺癌中LINK-A高表達確定本文的主角；為了驗證LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結合，作者分別進行RNA pull-down、RIP、dot-blot驗證並找出了與這兩種蛋白結合的RNA位點；EGFR/GPNMB信號通路的激活：作者分別用RNA pull-down、co-IP、純化標簽融合蛋白的co-IP等實驗驗證了胞外因子HB-EGF刺激信號通路使HIF1磷酸化；用FISH、RIP和胞外激酶實驗驗證HB-EGF刺激使細胞中EGFR/GPNMB與LINK-A、BRK/LRRK2互作；用體外激酶實驗和各種WB實驗檢測HIF1的磷酸化位點；作者先用co-IP驗證HIF1與P300的互作，再通過對LINK-A進行BRK、LRRK2結合位點的突變檢測HIF1的磷酸化和P300的結合來說明磷酸化的HIF1與P300互作是通過LINK-A與BRK、LRRK2結合後介導的；最後作者通過CHIP實驗驗證磷酸化的HIF1結合到靶標基因啟動子上促進基因的表達。

Figure1說明的是LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結合，並找到的與蛋白結合的RNA位點。

A、RNA pull-down，用LncRNALink-A探針釣取細胞內與之結合的蛋白，聯用質譜分析。

B、RIP實驗，用BRK和LRRK2蛋白抗體釣取與蛋白結合的RNA，然後進行Q-PCR檢測驗證Link-A與這兩種蛋白高度結合。

C-D、RNA pull-down，用LINK-A探針分別與純化的帶FLAG標簽融合蛋白BRK和帶MYC標簽的融合蛋白LRRK2孵育釣取結合蛋白，然後進行WB檢測表明LINK-A直接與BRK以及LRRK2蛋白結合。

E、斑點印跡雜交，體外將生物素標記的LINK-A與標簽融合蛋白結合然後進行斑點雜交檢測LINK-A與蛋白的結合位點區段。

F、RNA pull-down，用LINK-A全長和去除斑點印跡法檢測到的與蛋白結合位點的突變探針釣取蛋白，然後進行WB驗證LINK-A與蛋白的結合區段。

Figure2說明的是HB-EGF誘導LINK-A-蛋白復合體與信號通路蛋白EGFR/GPNMB結合，並促使HIF1磷酸化。

A、RNApull-down，細胞經HB-EGF誘導後，用LINK-A探針釣取RNA結合蛋白，然後進行質譜檢測，表明HB-EGF刺激使LINK-A結合蛋白GPNMB、BRK、HIF1等。

B、WB，分別用EGFR和GPNMB抗體檢測經生長因子處理後的細胞蛋白，結果表明HB-EGF處理後，EGFR與GPNMB結合。

C、Co-IP，用EGFR釣取經各種胞外因子處理後細胞中與之結合的蛋白，然後進行WB檢測，表明經HB-EGF處理後，EGFR與GPNMB結合。

D-E、分別用純化的帶標簽融合蛋白EGFR和GPNMB釣取經HB-EGF處理後細胞中的結合蛋白，然後進行WB驗證表明EGFR與GPNMB直接結合。

F、Co-IP，分別用BRK、GPNMB和HIF1蛋白抗體釣取經胞外因子處理後細胞中的結合蛋白，然後用HIF1磷酸化抗體進行WB檢測，結果表明HB-EGF誘導HIF1磷酸化。

G、體外激酶實驗，表明GPNMB被磷酸化。

H、用純化的GPNMB帶釣取經HB-EGF處理後中與之結合的蛋白，然後進行WB檢測，表明HB-EGF處理後BRK與GPNMB結合並被磷酸化。

Figure3說明的是HB-EGF誘導細胞EGFR/GPNMB與BRK、LRRK2互作。

A、FISH，分別對LINK-A敲低細胞經HB-EGF處理後的細胞中EGFR和BRK進行定位，表明HB-EGF處理使這兩種代表有互作。

B、LINK-A與蛋白BRF、LRRK2結合位點信息。

C、RIP，分別用LINK-A全長和去除蛋白結合位點的探針釣取細胞中與之結合的蛋白，然後用磷酸化的蛋白抗體進行WB驗證，表明GPNMB和BRK磷酸化並驗證了B圖所示的結合位點。

D、FISH，表明HB-EGF處理後的細胞中EGFR和磷酸化的BRK互作。

E-F、體外激酶實驗。

G、體外RNA-蛋白結合實驗，用完整蛋白和去除部分組分的蛋白與LINK-A全長和去除蛋白結合位點的RNA進行結合實驗。

Figure4說明的是HB-EGF激活信號通路BRK促進HIF1 Tyr565位點磷酸化，HIF1 Tyr565的磷酸化使Pro564羥基化。

A、體外激酶實驗，表明HIF1的磷酸化位點為Tyr565和Ser797。

B、體外激酶實驗，BRK促進HIF1 Tyr565位點磷酸化。

C、WB檢測HB-EGF誘導各種蛋白磷酸化情況。

D-F、LINK-A敲低後經HB-EGF誘導的各種蛋白磷酸化情況。

G、HB-EGF處理細胞不同時間後檢測HIF1 Tyr565和Ser797位點的磷酸化Pro564羥基化。

H、LINK-A敲低後經HB-EGF誘導的HIF1Tyr565和Ser797位點的磷酸化Pro564羥基化。

I、各種蛋白敲低後經HB-EGF誘導的HIF1 Tyr565和Ser797位點的磷酸化Pro564羥基

化。

Figure5說明的是LINK-A促進HIF1磷酸化，磷酸化的轉錄因子HIF1與P300互作促進靶標基因的轉錄。

A、co-IP，用HIF1抗體釣取LINK-A和LRRK2敲低後經HB-EGF誘導細胞中的結合蛋白，然後用WB驗證，表明磷酸化的HIF1與P300結合。

B、co-IP，用純化的帶標簽融合HIF1和Ser797位點突變的HIF1與細胞總蛋白孵育，然後用標簽抗體釣取結合蛋白進行WB驗證，表明Ser797位點突變的HIF1不能與P300結合。

C、將LINK-A全長和BRK、LRRK2結合位點突變的表達載體導入細胞，然後檢測經HB-EGF誘導後的磷酸化的HIF1，表明LINK-A的BRK、LRRK2結合位點突變後，HIF1不能磷酸化。

D-E、CHIP-seq，HIF1抗體釣取HB-EGF處理後的細胞中與之結合的DNA片段，然後進行高通量測序，C為HIF1結合的DNA富集motif，D為結合的靶標。

F、CHIP-q-pcr，HIF1抗體釣取HB-EGF處理後的細胞中與之結合的DNA片段然後進行Q-PCR驗證，表明HB-EGF促進HIF1與靶標基因啟動子結合。

❻ 一個蛋白質編碼基因實現其功能需要經歷那些階段通過哪些方式調控其功能的實現

經歷的階段：

1：經過轉錄形成了信使RNA信使RNA通過核孔，進入到細胞紙當中的內質網上的核糖體。

2：信使RNA又通過鹼基互補配對，將一個個轉運RNA連接在一起，此時就得到了初期的蛋白質。

3：內質網用膜把這些蛋白質包被起來，運送到高而基體，進行進部分加工，也是最終的加工。

方式調控：

1：轉錄前調控，主要有轉錄因子的調控和表觀調控。轉錄因子調控就包括起始子，增強子之類的。

2：轉錄後調控主要是RNA的剪切。MRNA的壽命及穩定性和小RNA干擾，翻譯後調控就是蛋白質的多種修飾了。

(6)轉錄後調控的研究方法擴展閱讀：

1：早期發現的基因多數是編碼蛋白質的基因，即DNA序列通過一定的規則指導蛋白的合成。蛋白質是地球上大多數生物體的必要組成成分，參與了細胞生命活動的每一個進程。

2：終產物是RNA的基因，是不指導生成蛋白質，而是以RNA的形式起作用，常被稱為非編碼基因。

3：以疾病防治為目標的基因檢測通常針對蛋白編碼基因，但隨著對非編碼基因研究的深入，針對它們的基因檢測也會越來越多。

❼ 基因表達調控的方式有哪些

基因表達調控分為很多水平：
1.DNA、染色體水平調控：基因丟失、基因修飾、基因重排、基因擴增、染色體結構變化。
2.轉錄水平調控（主要調控方式）：轉錄起始、延伸、終止均有影響。原核生物藉助於操縱子，真核生物通過順式作用元件和反式作用因子相互作用進行調控。
3.轉錄後水平調控：主要指真核生物原初轉錄產物經過加工成為成熟的mRNA，包括加帽、加尾、甲基化修飾等。
4.翻譯水平調控：對mRNA穩定性的調控、反義RNA對翻譯水平的調控等。
5.翻譯後水平調控：蛋白質的剪切、化學修飾（磷酸化、乙醯化、糖基化等）、轉運等。
6.mRNA降解的調控。

❽ 通過什麼方法，想要研究某個過程是否影響一些基因的轉錄後調節

控制其他過程不變，只改變這個過程，通過pcr測定轉錄產物的量是否變化，可以知道是否影響了轉錄量。通過測序的方法可以知道這一過程是否影響到了轉錄後的修飾。

❾ 轉錄因子相關調控研究案例（一）

由8q24基因編碼產生的一種新型LncRNA CCAT2促進癌細胞的轉移進程和增強染色體的穩定性 。

LncRNA CCAT2由rs69x3267snp基因轉錄產生，CCAT2的表達結合轉錄因子TCF7L2並將其結合到靶標基因啟動子上促進基因轉錄為RNA，這些靶標基因編碼與細胞增殖相關的蛋白，同時轉錄的RNA經剪切加工後可產生miR-17-5p。

作者首先用Q-PCR檢測結腸癌病人樣本中結腸癌細胞和癌旁組織細胞的LncRNA表達，表明LncRNA CCAT2在結腸癌細胞中高表達，然後用原位雜交驗證LncRNA在結腸癌細胞中的高表達從而確定了本文的主角LncRNA CCAT2。隨後作者對CCAT2分別進行功能研究和作用機制研究。

（1）功能研究：作者建立CCAT2的過表達穩定細胞株進行小鼠體內成瘤試驗和細胞遷移試驗，建立CCAT2敲低穩定株進行細胞侵襲實驗和基因不穩定性檢測說明CCAT2對腫瘤細胞增殖的作用。

（2）機制研究：機制研究可分為兩個方面，一是在較大的方向上說明CCAT2促進MYC和miR-17-5p的表達，二是說明CCAT2通過招募轉錄因子促進MYC和miR-17-5p表達。作者首先用Q-PCR和WB檢測CCAT2過表達/敲低細胞的MYC的表達說明CCAT促進MYC基因轉錄為mRNA，用q-pcr檢測CCAT2過表達後microRNA的表達說明CCAT2促進miR-17-5p的表達，通過添加microRNA的反向互補序列檢測細胞的遷移，說明miR-17-5a促進細胞遷移。作者用Q-PCR檢測細胞核質分離後的CCAT2表明CCAT2在細胞核內，隨後通過CHIP和RIP實驗驗證CCAT2和轉錄因子TCF7L2與Myc啟動子結合，然後用FISH檢測CCAT2過表達細胞的MYC表達等一系列實驗說明CCAT2通過招募轉錄因子激活基因轉錄促進蛋白表達。最後作者檢測CCAT2過表達後的CD44和vim mRNA說明CCAT2促進這兩種基因轉錄。

Figure1.說明的是LncRNA CCAT2促進MYC、miR-17-5p、miR-20a的表達，促進細胞增殖轉移 。

A、 分別用WB和Q-PCR檢測CCAT2過表達後的MYC表達，表明CCAT2過表達促使MYC表達升高。

B、 Q-pcr檢測CCAT2過表達後的microRNA的表達，結果表明CCAT2過表達使miR-17-5p和miR-20a表達升高，miR-146a表達下降。

C、 別用WB和Q-PCR檢測CCAT2敲低後的MYC表達，表明CCAT2敲低促使MYC表達下降。

D、 通過添加microRNA的反向互補序列檢測細胞的遷移，表明miR-17-5a和miR-20a的互補序列使細胞遷移能力下降。說明miR-17-5a和miR-20a促進細胞遷移。

Figure2.說明的是CCAT2結合轉錄因子TCF7L2到MYC等基因啟動子上促進表達。

A、 核質分離後，q-pcr檢測CCAT2，表明CCRT2在細胞核內。

B、 CHIP實驗，用轉錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與之結合的DNA片段，然後進行q-pcr檢測，表明TCF7L2與MYC啟動子結合。

C、 RIP實驗，用轉錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與之結合的RNA片段，然後進行q-pcr檢測，表明TCF7L2與lncRNA CCAT2結合。

D、 蛋白FISH，用熒光免疫原位雜交檢測CCAT2過表達細胞的波形蛋白，表明CCAT2過表達細胞的波形蛋白信號很強。

E、 Q-PCR檢測CCAT2過表達後的CD44和波形蛋白mRNA的表達。

❿ 真核生物基因表達調控有哪些環節

可分為三種主要途徑環節：

1、遺傳調控（轉錄因子與靶標基因的直接相互作用）；

2、調控轉錄因子與轉錄機制相互作用，

3、表觀遺傳調控（影響轉錄的DNA結構的非序列變化）。

轉錄調控

通過轉錄因子直接調控靶標DNA表達是最簡單和最直接的轉錄調控改變轉錄水平的方法。基因的編碼區周圍通常都具有幾個蛋白質結合位點，具有調節轉錄的特定功能。常見的調控蛋白質與DNA結合的位點有增強子、絕緣子和沉默子。調節轉錄的機制非常多樣，可以阻斷DNA上與RNA聚合酶結合的關鍵位點，也可以充當激活劑輔助RNA聚合酶結合來促進轉錄。

轉錄因子的活性進一步受到細胞內信號的調節，引起蛋白質翻譯後修飾，包括磷酸化乙醯化或糖基化。這些變化影響轉錄因子直接或間接轉錄因子與啟動子DNA的 結合、RNA聚合酶的募集以及新合成RNA分子的延伸。

真核生物中的核膜通過允許這些轉錄因子在細胞核中存在的持續時間來進一步調控轉錄環境刺激或內分泌信號可能導致調節蛋白的修飾，引發細胞內信號的級聯，導致基因表達的調節。