A. 如何进行目的基因片段分离，克隆和分析
分离目的基因
生物芯片是高密度固定在固相支持介质上的生物信息分子的微列阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核算类物质，主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点阵两种。
分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）基因。目前是通过①比较不同物种之间，或同一物种不同个体之间；或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异表达（基因表达平行分析）来实现的。采用基因芯片技术进行基因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mRNA的种类及丰度，与传统的差异显示相比具有样品用量小，自动化程度高，被检测目标DNA密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针从cDNA或EST微列阵中筛选分离目的基因。目前有DNA 芯片、cDNA芯片两种。其基本步骤包括：基因芯片的制备、靶样品制备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。
2 基因文库技术分离目的基因
基因文库指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体的形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑，或成活细胞）即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。其类型很多，如可分为基因组文库与cDNA文库、克隆文库与表达文库，按载体分有智力文库、噬菌体文库、黏粒载体文库、人工染色体文库等。基因文库构建后，从文库中筛选基因的方法主要有以下几种：核算杂交法、免疫学检测法、DNA同胞选择法、PCR筛选法等。基因文库的构建是目前基因工程的核心工作，也是分离目的进的常用方法之一。
3 功能蛋白组分离目的基因
蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如：应用PCR进行分离目的基因：通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设计简并引物，可利用RT-PCR 得到目的基因的全长；应用核算杂交筛选法分离目的基因：即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库；免疫雪筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。
4 PCR技术在基因克隆中的应用
PCR技术已经渗透到生物学的各个领域，在分子克隆和获得cDNA全长方面起着重要的作用。利用 PCR技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mRNA差别显示（DDRT-PCR）可鉴定和分离出所需的目的基因；通过RT-PCR克隆到目的基因的 cDNA区域进行cDNA文库的构建，通过锚定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。现在可用于基因分离和克隆的 PCR方法主要有：RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小节），用于DNA序列克隆的Panhankle- PCR、Cassette-PCR以及减法cDNA文库的PCR法构建等。Panhankle-PCR、Cassette-PCR为基因组已知DNA相临未知序列的克隆奠定了良好的基础。
5 mRNA差别显示技术分离差别表达基因
mRNA差异显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速行之有效的方法之一。它是将mRNA反转录与PCR技术结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。它利用5’锚定引物oligo（dT）12MN和3’端随机引物对总mRNA进行PCR扩增，以期得到差异表达的条带。并对其差异显示的条带进行回收、克隆。
6 插入突变分离克隆目的基因
获得突变体进行未知基因的克隆是常用的方法之一。这里举T-DNA标签法和转座子诱变分离克隆目的基因的例子。T-DNA标签法是将T-DNA在任何感兴趣的基因处产生插入性突变，获得分析该基因功能的对照突变体。它将T-DNA左右边界之间携带的外源报告基因片段作为一个选择性的遗传标记，因为插入的序列是已知的，因而对获得的转基因重组突变体就可以通过各种克隆和PCR策略加以研究。倘若将35S强启动子在T-DNA整合到宿主基因组后，整合到内原基因的上游，则可以产生异常增加或表达的时空特异性改变而破坏基因的表达的效果。有获得性突变和功能丧失性突变等。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的植物与遗传上有差异的同种植物杂交，因转座因子插入到某一特定的基因序列而破坏了该基因编码的蛋白，进而导致可见的表性的破坏或改变，这样就可以在产生后代中筛选出新型的突变体。
B. 已知一个物种的基因组,怎么克隆目的基因
这个呢一般的做法就是首先构建基因文库或者cDNA文库， 基因文库和cDNA文库建立起来后，下一步的工作是从一个庞大的基因库中分离出所需要的重组体克隆，这是一件难度很大，费时费力的工作。一种方法是根据重组体某种特征从库中直接挑选出重组体，这种方法叫做“选择”；另一种方法是把库中所有的重组体进行一遍筛查，这种方法叫做“筛选”。
1.原位杂交法：这一种利用特异探针的直接选择法，是一种十分灵敏而且快速的方法，用于杂交的探针可以是双链DNA，也可以是单链DNA，或是RNA。杂交的检测常用放射性同位素标记探针，通过自显影来进行。显然，有效进行杂交筛选的关键是获得特异的探针。探针的获得有如下方法：
①如果目的基因序列是已知的，或部分序列是已知的，探针可以从已有的克隆中制备，或用PCR方法扩增。
②如果目的基因是未知的，而有其他物种的同源序列，那么可以用同源序列做探针。
③如果目的基因未知，
但知道它对应的蛋白质序列，
可根据蛋白质序列设计相应的核酸探针。
2．扣除杂交法：这是一种筛选方法，难度很大，是面对目的基因未知，同源基因未知，蛋白质序列未知的情况的。基本原理是找到该基因的高表达细胞，提取相应的mRNA，并与一般细胞提取的mRNA进行比较，分离一般细胞不存在而高表达细胞存在的mRNA，然后用该mRNA逆转录生成cDNA。
另外，若目的基因已知的话，简单的PCR扩增就行了。
C. 筛选检测基因克隆的常见方法有哪些
这是一套通用方法，简单方便。利用目的基因筛选就要考虑各种情况，很麻烦：能否顺利表达（克隆载体不表达，原核真核，修饰定位、辅因子等等）；是否便于筛选（抗生素筛选很方便，如果目的基因是酶、转录因子或结构蛋白，怎么筛选？）；不能通用（每研究一种蛋白，就要换一种载体/宿主/筛选方法）...
D. 利用基因工程技术进行药物的研制与开发时，目的基因的鉴定方法有哪些其原理是什么
目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。以下就常用技术的基本原理加以介绍。
一、根据重组载体的标志作筛选
最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。 载体含有lacZ’的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。 根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。
二、核酸杂交法
利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（auroradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。
三、PCR法
PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。
四、免疫学方
利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合的作用进行筛选。此法不是直接筛选目的基因，而是通过与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。抗体可用特定的酶常用过氧化物酶、碱性磷酸酶等标记，结合酶标抗体处，酶可催化特定的底物分解而呈现颜色，从而指示出含有目的的基因的细胞集落位置。免疫学方法特异性强、灵敏度高，适用于从大量转化细胞集合体中筛选很少几个含目的基因的细胞克隆。
五、DNA限制性内切酶图谱分析
这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱（restriction map）发生变化，例如一个长600bp的目的序列利用它两端的EooR I和SalI切后的粘末端连接插入pUC19的多克隆点，则重组质粒就增大为3.3kb，用Eoor I和SalI双酶切后会出现600bp和-2.7kb两个DNA片段，提取转化细菌的质粒DNA作酶切后做电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。
六、核苷酸序列测定
所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，用进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。核酸序列测定的原理和方法在实验教材中有详细的叙述。
E. 基因克隆有哪些步骤，如何筛选阳性克隆
简单的说一下：
1.
扩增目的基因，比如通过PCR的方法。
2.
PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO
TA的方法插入到载体质粒。
3.
转染大肠杆菌
4.
筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。
5.
挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。
F. 定位克隆的筛选方法
也即Northern杂交分析法。用候选区域基因组DNA作为探针与总RNA杂交，切下阳性条带，反转录为cDNA并克隆，即可获得位于此基因组片段中的转录子。
上述方法都各有其优缺点，必须根据原材料及要达到的目的，选择适当的一种或多种方法组合来达到研究目的。此外，其它方法还很多，如微切割和微克隆法、减法cDNA杂交法、重组筛选法等。 依赖特征序列的方法是依据转录子内部及其两侧的序列特征直接从基因组DNA中分离cDNA片段，主要有CpG岛搜寻法、外显子捕获法(exontrapping)、交叉物种序列同源性比较法(cross-speciessequencehomology)、AluPCR法与直接序列分析法等。CpG岛也称为HTF岛，是一些富含GC的小区域。大部分转录子的附近(通常是在5′上游区域)都含有非甲基化的CpG岛。利用一些识别CpG岛的稀有酶，如SacⅡ、BssHⅡ、EagⅠ等，切割基因组DNA，获得位于CpG岛附近的序列作为探针从总RNA或cDNA文库中得到转录子。外显子捕获法是基于对外显子两侧的功能性5′和3′剪接位点的识别，从基因组DNA中分离外显子片段。交叉物种序列同源性比较的依据是编码区序列在不同物种间的保守性要远高于非编码区，把候选区域的DNA分为多个亚克隆，分别与不同的物种总DNA杂交，与不同物种DNA都有阳性信号的DNA克隆可能就是编码区基因。这种方法依赖的是物种间DNA水平上的序列同源性。Alu序列是散布于人基因组中的短的重复序列，通过设计人特异的Alu序列作为引物，可直接快速用PCR方法从YAC、BAC、PAC克隆或人鼠杂合细胞中得到人源的特异序列。直接序列分析法则在基因组序列信息中用GRAIL和GeneScan等软件分析推测编码基因的方法。
G. 基因克隆的方法有哪些
简单的说一下：
扩增目的基因，比如通过PCR的方法。
PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。
转染大肠杆菌
筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。
挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。
H. 怎样克隆一个目的基因
目的基因的克隆是利用一个单一的基因副本的行为。有pcr方法，凝胶电泳方法，色谱法，琼脂糖凝胶电泳法，质粒法等。具体方法可分别检索文献。
常用的植物目的基因克隆技术
1、通过已知基因产物的分析和鉴定
这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。
2、通过遗传表型分析
（1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。
（2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共’�虮嗦氲氖芴逯�浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担�圆≡�し⒆拥鞍孜�咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共’�颍�绶�延胛薅净�騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。
3、以图谱为基础的定位克隆技术
以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。
I. 如何从基因文库中筛选目标克隆
你的cDNA文库不是保存在宿主里吗？以前的方法是做大量的平板，然后用原位杂交的方法去筛选阳性的克隆，多筛几次就好了，但做平板其实很累的。
现在的方法可以用RACE钓取全长的cDNA。关于RACE，你可以咨询试剂公司，有现成的试剂盒和方法可用。
