微生物遗传型的鉴定方法有哪些

A. 请问一下菌种鉴定的方法和实验步骤

实验步骤：菌种鉴定工作是各类微生物学实验室都经常遇到的基础性工作。不论鉴定对象属哪一类，其工作步骤都离不开以下三步：①获得该微生物的纯种培养物；②测定一系例必要的鉴定指标；③查找权威性的鉴定手册。 一、经典分类鉴定方法 群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态等
* 形态 个体：细胞形态，染色反应，各种特殊构造等
* 营养要求：能源，碳源，氮源，生长因子等
* 生理、生化反应 酶；产酶种类和反应物性等
* 代谢产物：种类，产量，显色反应等
* 经典指标 生态特性：生长温度，对氧的需要，宿主种类等
* 生活史特点
* 血清学反应
* 噬菌体的敏感性
* 其它
经典分类法
经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。 * A. 能在 60 o C 以上生长
* B. 细胞大，宽度 1.3~1.8mm ………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )
* B. 细胞小，宽度 0.4~0.8mm
* C. 能以葡萄糖为碳源生长
* D. 能在 pH4.5 生长 …………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus )
* DD. 不能在 pH4.5 生长 …………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus )
* CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源 ……………… 4. 栖热嗜油菌属 ( 栖热嗜狮菌属 Thermoleophilum )
* AA. 不能在 60 o C 以上生长
二、现代分类鉴定方法
* 近年来，随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用，促使微生物分类鉴定工作有了飞速发展。对微生物鉴定工作来说，已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学特性的鉴定、细胞化学组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类研究等新的层次上。
* （一）微生物遗传型的鉴定
* DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。每一种微生物均有其自己特有的、稳定的DNA成分和结构，不同微生物间DNA成分和结构的差异程度代表着它们间新缘关系的远近。因此，测定每种微生物DNA的若干重要数据，是微生物鉴定中极其重要的指标：
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 每一个微生物种的 DNA 中 GC mol% 的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间， DNA 中 GCmol% 的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的 GC mol% 范围。 DNA 中 GC mol% 分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌 DNA 中 GC 含量的变化范围一般在 25 ％～ 75 ％；而放线菌 DNA 中的 GC 比例范围非常窄 (37 ％～ 51%) 。一般认为任何两种微生物在 GC 含量上的差别超过了 10 ％，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用 G+C mol ％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其 G+C mol ％含量相同或者近似，但 G+C mol ％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的 DNA 的 GC mol% 在 37 ～ 51 之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。要比较两种细菌的 DNA 碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 1）每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。
* 2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。
* 3）使用原则：
* G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的G+C含量，若不同生物之间G+C含量差别大表明它们关系远。但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%。所以G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。
* 若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。
* 在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C含量是一项重要的，必不可少的鉴定指标。其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元。
2.核酸的碱基组成和分子杂交：* 与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。
DNA-DNA 杂交
* DNA 杂交法的基本原理是用 DNA 解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的 DNA 在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链 DNA ，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链 DNA 的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为 100% 。如果两条单链 DNA 的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于 100% 。由此；杂合率越高，表示两个 DNA 之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的 DNA 杂合率可高达 100 ％，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的 DNA 杂合率较低，约有 70 ％。 G+Cmol ％的测定和 DNA 杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。
DNA — rRNA 杂交
* 目前研究 RNA 碱基序列的方法有两种。一是 DNA 与 rRNA 杂交，二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。 DNA 与 rRNA 杂交的基本原理、实验方法同 DNA 杂交一样，不同的是① 是 DNA 杂交中同位素标记的部分是 DNA ，而 DNA 与 rRNA 杂交中同位素标记的部分是 rRNA 。② DNA 杂交结果用同源性百分数表示，而 DNA 与 rRNA 杂交结果用 Tm(e) 和 RNA 结合数表示。 Tm(e) 值是 DNA 与 rRNA 杂交物解链一半时所需要的温度。 RNA 结合数是 100 m gDNA 所结合的 rRNA 的 m g 数。根据这个参数可以作出 RNA 相似性图。在 rRNA 相似性图上，关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌在图上占据不同的位置。用 rRNA 同性试验和 16SrRNA 寡核苷酸编目的相似性比较 rRNA 顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌的建立。
3.建立16 S r RNA系统发育树
* a）使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群；
* 传统的生物进化研究，主要基于复杂的形态学和化石记载，因此多限于研究后生生物（metazoa），而后者仅占整个生物进化历程的1/5
* b）提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法；
* c）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据；
* d）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全新的微生物分类、鉴定理论；
* e）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进行研究。
3、 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析
* 首先， 16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中。 rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三， 16S rRNA 的相对分子量大小适中，约 1 540 个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。
分离菌株 16S rRNA 基因
* 。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞 , 加入 100μL 无菌重蒸 H 2 O 中 , 旋涡混匀后 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 离心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用于 PCR 扩增。分离菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测定的一般步骤为： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ； 5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3' 。扩增反应体积 50 m L ，反应条件为 95 ℃预变性 5min ， 94 ℃变性 1min ， 55 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min ，共进行 29 个循环， PCR 反应在 PTC-200 型热循环仪上进行。取 5 m L 反应液在 10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 PCR 产物测序可由专门技术公司完成。
比对分析
* 测序得到 分离菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用写字板或 Editsequence 软件打开，将所得序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进行比对分析 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ) ，具体步骤如下：点击网站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] 选项，将测序所得序列粘贴在“ search ”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“ blast ”，然后点击“ format ”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断 16S rDNA 鉴定结果。
比对分析
* 遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用 DNAStar 软件包中的 MegAlign 程序计算样本间的遗传距离。由 GenBank 中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入 Clustalx1.8 程序进行 DNA 同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入 Phylip3.6 软件包，以简约法构建系统发育树。使用 Kimura 2-parameter 法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（ Bootstrap ） 500 次重复检测， DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。
（二）细胞化学成分的鉴定* 除上述核酸成分外的其它化学成分的测定，是微生物化学分类法的重要内容，主要包括：1.细胞壁的化学成分。2.全细胞水解液的糖型。3.磷酸类脂成分的分析。4.枝菌酸的分析。5. 醌类的分析。6.气相色谱技术的应用。
（二）细胞化学成分的鉴定
* 微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分类法 (chemotaxonomy) 。在近二十多年中，采用化学和物理技术采研究细菌细胞的化学组成，已获得很有价值的分类和鉴定资料，各种化学组分在原核微生物分类中的意义见表
细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用
细胞化学成分鉴定的意义
* 随着分子生物学的发展，细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性。细胞壁的氨基酸种类和数量现己被接受为细菌属的水平的重要分类学标准。在放线菌分类中，细胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据，已被广泛应用。脂质是区别细菌还是古菌的标准之一，细菌具有酰基脂 ( 脂键 ) ，而古菌具有醚键脂，因此醚键脂的存在可用以区分古菌。霉菌酸的分析测定己成为诺卡氏菌形放线菌分类鉴定中的常规方法之一。鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇杆菌等细胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有无可作为此类细菌的一个重要标志。此外某些细菌原生质膜中的异戊间二烯醌，细胞色素，以及红外光谱等分析对于细菌、放线菌中某些科、属、种的鉴定也都十分有价值。
（三）数值分类法
* 数值分类法亦称统计分类法，是在约200年前与林奈同代人M.Adanson (1727 ~1806，法国植物学家)发展的分类原理基础上借助于现代的电子计算机技术而发展起来的。数值分类的基本步骤为：（1）计算两菌株间的相似系数；（2）列出相似度矩阵；（3）将矩阵图转换成树状谱。
数值分类的基本步骤
数值分类法
* 又称阿德逊氏分类法 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为 50 ～ 60 个，多者可达 100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵 ( 图 14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱 (dendrogram) ，再结合主观上的判断 ( 如划分类似程度大于 85 ％者为同种，大于 65 ％者为同属等 ) ，排列出—个个分类群。
数值分类法的优越性
* 数值分类法的优越性在于它是以分析大量分类特征为基础，对于类群的划分比较客观和稳定；而且促进对细菌类群的全面考查和观察，为细菌的分类鉴定积累大量资料。但在使用数值分类法对细菌菌株分群归类定种或定属时，还应做有关菌株的 DNA 碱基的 G + Cmol% 和 DNA 杂交，以进一步加以确证。

B. 微生物遗传学的研究方法

除了一般的微生物学研究方法以外，在微生物遗传研究中最突出的方法是突变型的筛选和选择性培养方法的应用。突变型一方面可作为染色体的标记，另一方面可用来剖析各种生命活动的遗传控制。为了后一目的，必须获得特定类型的突变型。在高等动植物中，虽然也有一些筛选特定类型的突变型的例子，但是多数突变型是由于偶然出现枝察猜而长期积累起来的。微生物遗传学研究则不同，一般工作常从筛选特定的突变型开始，例如筛选不能合成某一种氨基酸的突变型（营养缺陷型）、对于某一种药物或噬菌体具有抗性的突变型、在较高温度中不能进行DNA 复制的突变型、转化过程中发生遗传性障碍的突变型、某一特定的酶发生缺陷的突变型以及导致某一种蛋白质的某一功能区发生变化的突变型等。微生物遗传学的迅速发展和便于取得所需要的突变型有着密切的关系。
特定类型的突变型的筛选之所以能够成功，主要是应用选择性培养基的结果。例如把大量对某种药物敏感的细菌接种在含有该种药物的培养基上，在这上面能形成菌落的细菌便是发生了抗药性突变的细菌。这一原理也应用于突变的研究、细菌接合的研究、转导的研究、基因精细结构分析的研究(见基因定位)和基因调控的研究等。选择性培养方法的应用大大提高了工作效率，在基因重组的分析中一般需要测定杂交子代中亲本组合和重组类型的比率；两个基因的距离愈近，则发现重组类型猛型所须分析的子代个体愈多。同一基因内部的两个突变位点的距离必然更近，因此在高等动植物中较难发现它们之间的重组。在微生物中应用选择性培养方法，可以检出距离十分接近的两个突变位点之间的重组，因为特定的选择条件能淘汰绝大多数非重组个体，而只使为数有限的重组体存活。例如大肠杆菌T4噬菌体的快速溶菌突变型rⅡ能感染寄主细菌大肠杆菌B而形成噬菌斑，但在大肠杆菌K上则不能形成噬菌斑。用大肠杆菌K作为选择性培养条件,便能检出两个十分接近的rⅡ突变位点之间发生重组而出现的野生型噬菌体。由于选择性培养方法的应用，才有可能在较短时间测定大量的这没渗类突变型，非但提高了工作效率，还从根本上改变了对基因的认识。

C. 微生物遗传研究利器—Tn-Seq 转座子测序技术

转座子测序技术（Tn-seq）是一种结合了转座子插入诱变与二代测序技术的高效研究方法，主要用于细菌基因功能的深入探究。此技术的核心是构建转座子插入文库，其中大部分或全部非必需基因（non-essential genes）均携带插入片段。通过特定体外或体内培养，测序确定实验前后种群中突变体的相对频率。从数据中，量化每种情况下的基因适应性贡献，识别必需基因与特定表型的相关性，如抗生素抗性基因的鉴定。

Tn-seq技术自2009年首次发布以来，已发展出多种用于细菌的转座子插入测序方法，包括INSeq、HITS和转座子定向插入位点测序等。杭州沃森生物技术有限公司自主开发的Tn-seq建库流程，能兼容多种突变体库构建方法，仅需提供转座子序列信息，即可构建二代测序文库进行后续分析。

技术流程包括转座子插入、构建文库、测序和数据分析等步骤。流程图具体展示了各步骤的操作细节。数据分析阶段，将测序数据转换为可解读的生物信息，以便进一步研究和理解基因功能。结果可视化则以直观的方式展示研究发现，如基因活性、突变频率等。

已有文献证明了Tn-seq技术的效能，如Jiawen Xiao的研究分析了在营养压力下Pantoea agglomerans关键基因的生存机制，Fan Yin的研究揭示了多重耐药猪肠外病原性大肠杆菌在体内适应性的关键基因。

杭州沃森生物技术有限公司，凭借丰富的分子生物学尤其是NGS应用经验，为精准医学和科研领域提供高品质产品和成本优化解决方案。公司产品线涵盖分子生物学、细胞生物学实验相关产品，前沿生物技术平台如数字PCR、单细胞测序，以及分子诊断、细胞基因治疗等方向的试剂、原料、耗材、仪器等。在紫金港科技城设有专业生物学实验平台和十万级洁净度标准生产车间，自有品牌麦伯生物，提供定制化的试剂耗材解决方案和产品。

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D. 请教病原微生物分型的方法种类及优劣势比较。谢谢！

病原微生物的分子分型方法
近年来，随着分子牛物学技术快速发展，新的诊断技术和方法不断涌现并广泛应用于临床微生物的检测，为病原微牛物的致病性、流行性、变异性以及耐药性分析等方面提供J，重要的信息。目前，应用分子生物学技术对病原微牛物进行分型的方法包括：脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gelelectrophoresis。PFGE)分型、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分型、生物芯片分型、多位点序列分型(muhilocus sequencetyping，MI。ST)、质粒DNA图谱分型以及限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分型等。
1．脉冲场凝胶电泳分型PFGE技术以其重复性好、分辨力强而被誉为细菌分子分型的“金标准”。它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb，而普通琼脂糖凝胶电泳仅能分离小于500 Kb的DNA。PFGE的基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在凝胶中的DNA分子的泳动方向发
生改变，小分子DNA比大分子DNA泳动快，从‘‘ii在凝胶上按DNA分子大小呈现出特异的电泳图谱。病原微生物的基因组DNA经脉冲场凝胶电泳，使大片段DNA有效分离。DNA条带的密度反映了病原微生物基因组DNA的含量以及分子的大小，最终达到分型的目的。目前，PFGE已被广泛的应用于病原微牛物的分型，Swaminathan等∽J已经建立了针对大肠杆菌0157：H7、沙门菌属的Typhimurium血清型、李斯特菌、志贺菌属等病原微生物分型的标准PFGE操作方法。有研究认
为PFGE的分辨力强于核糖体分型和随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)分型。当采用1个限制件核酸内切酶的分辨力不强时，可以采用2种限制性核酸内切酶加以提高。当然，PFGE也有一些局限，如耗时长、成本高等。另外，电泳图谱易受操作人员技术水平等因素的影响，这为不同实验室问的比较带米一定困难¨
2．聚合酶链反脱分犁PCR技术自1985年发明以来，以其灵敏度高和特异性强受到了人们的高度重视，成为核酸扩增和检测的一种常规方法H]。用于病原微生物分子分型的PCR方法主要有RAPD分型和重复序列PCR分犁2种。RAPD是建移在PCR基础卜-的1种可对整个未知序列的基因
组进行多态性分析的分子生物学方法。该方法以基冈组DNA为模板，以单个人T．合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基)为引物，在热稳定的DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚内烯酰胺凝胶电泳后，对其进行多态性分析。反应小同基因组DNA特点，从而对病原微生物进行分型。RAPD可以在物种没有任何基因组信息的情况下分析其DNA多态性，对模板DNA的纯度要求不高。无需DNA探针和分子杂交。重复序列PCR分型足Versalovic于1996
年描述的1种细菌基因组指纹分析方法，即PCR扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，经电泳图谱比较分析揭示基因组间的差异[5]。研究表明重复序列PCR分型与RAPD分型有相同的分辨力[6]，但操作相对复杂。然而，重复序列PCR分型的再现性非常好，这是RAPD无法比拟的。此外，多重PCR、巢式PCR等也呵用于病原微生物的分型，虽然各有长处，但也存在分辨力弱、重复性差、结果解析困难等不足，因此，还未广泛应用于临床。
3．生物芯片分型 生物芯片技术是将生物大分子，如寡核苷酸、cDNA、基冈组DNA、肽、抗原以及抗体等固定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵，当待测样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后，利．}}j激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析例。其用于病原微生物分型的基本原理是将代表各个亚型的特异基因制成1张芯片，经反转录就可检测样本中病原微生物的亚型进行辨别。液态芯片(suspension arraytechnology，SAT)，又称微球蛋白芯片(proteinbeadarrays，PBA)，是近年来出现的1种新的芯片技术。其原理是甩2种荧光染料按照不同比例将直径为5．6 ttm的微球染成100种颜
色，每种颜色的微球共价结合1种牛物探针，可以是抗原、抗体、配体，也可以是核酸或酶，分针对1种待检物。混合载有100种不同颜色的微球，就可以在1个反应孔里同时完成100种不同的生物反应。随后微球成单列通过2束激光照射的管道，计算机采集并处理每种颜色微球的荧光强度变化就可以分别对每个待测物进行定性或定量的检测。该系统口‘用于多种微生物抗原、抗体和特定基因的联合检测。目前，该方法已应用于临床HPV的分型检测。与固态芯片相比，液态芯片在反
应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优势，因此，不少学者看好液态芯片的应用前景。
4．多位点序列分型 随着DNA测序技术的快速发展，分子分型日益趋向于染色体的单一或多个位点的多态性上。MI。ST分型是指测定对多个管家基囡中长度约为470 bp的核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。Maid—en等[83发现，MI，ST可用于脑膜炎奈瑟球菌的分型。他们认为，多个管家基因的序列分析比较在实验过程的ⅡI操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验窜问具有良好的可比性，即MLST对某哆菌株具有较强的种内分辨力【9 J。Chen等no]应用MLST对我国台湾地区12家医院分离到的51株白色假丝酵母菌进行遗传特征分析，结
果发现了7个管家基因序列的83个多态性位点和45个二倍体序列类型。其中，36．1％是同义突变，63．9 oA为非同义突变。他们认为，MI。ST的分辨力较PFGE更强，能分辨某患者所感
染的白色假丝酵母菌随时间推移‘‘ii发生的微小种内进化。但MLST的缺点是它的高额费用和操作过程所需的特定仪器。这使得这项技术只能局限在大型的全球性流行病学研究中心
使用，影响其在医院推广普及。
5．质粒DNA图谱分型 细菌质粒分析是较早被使用的病原微牛物分子分型方法。该方法包括萃取质粒DNA和琼脂糖凝胶电泳。由于不同菌株质粒DNA序列和大小不同，
通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA质粒图谱也不同，从而可以对不同菌株进行分型。菌株携带的质粒越多则质粒DNA图谱分型方法的特异性越强。质粒网谱分型的优点是操作相对简单，只需要简单的设备就可以完成，耗时短，费用低廉。但质粒图谱分型有一难以克服的缺陷。即质粒可以自发的丢失、获取以及在同种细菌甚至是在异种细菌之间转移，这就造成了质粒图谱的不稳定性。另外，质粒图谱型方法小能区分那些大小相同而DNA序列不同的质粒¨“。
6．限制性片段长度多态性分型 RFI。P是指基因组DNA经限制性核酸内切酶消化，消化后的片段再通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。用限制性核酸内切酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因组DNA，可以产生大量短的片段，通过电泳后得到的DNA图谱可用于病原微生物的分型。几乎所有
的病原微牛物分离株都町以通过这种方法分型，但由于基因组DNA巨大，酶切后产生的片段众多，且含有大量的莺叠片段，这使得蔚株间图谱的一致性分析面I临诸多用难口“。RFLP分
型分辨力弱于PFGE分型，且操作比较复杂。

E. 哪些标识可以简单识别细菌、病毒的遗传

细菌与病毒是两种完全不同的微生物。

细菌是微生物的一大类。大小约一至数微米，呈球形、杆形、弧形、螺形或长丝形。有的具芽孢、鞭毛或英膜。以二等分分裂繁殖为主。除部分自养细菌外，多营腐生或寄生生活。遍布于土壤、水、空气、有机物质中及生物体内和体表。对自然界物质循环起着巨大作用。某些种类能提高土壤的肥力。不少种类可用于发酵工业，生产食品、化学品和医药品等。某些种类可用于细菌冶金和石油脱蜡。若干种类能引起人和动植物病害或工农业产品的霉腐。一般来就构成细菌的细胞没有细胞核。在细菌的内部，多数具有一层粘滑外罩的刚性细胞壁，上面有些被称为纤毛的微细绒毛，其中较长较粗的另被称之为鞭毛，它的蠕动能使细菌运动起来。另外细菌也没有能获取能量的线粒体。不过它们却有一个单一的DNA环，是一病毒核心，还有粒状斑点和核蛋白体，它可产生出细菌蛋白质。

以细菌为宿主的病毒。又称噬菌体。分为10科，其中肌病科，如T2、T4噬菌体等；长尾病毒科，如λ、T5噬菌体等；短尾病毒科，如T7、P22噬菌体等。噬菌体因其所具有的特性而成为探讨核酸（DNA和RNA）的复制、转录、重组、基因表达的调节控制、病毒与宿主的关系等各方面的研究对象，促进了病毒学、分子生物学、遗传学的发展。在临床医学中，曾试用噬菌体诊治某些细菌性感染的疾病。噬菌体的污染可能给发酵工业（如食
细菌和病毒的区别可以从三个方面来阐述：

1.形态方面

细菌的大小远比病毒大，通常细菌的大小以微米来衡量，而病毒的大小以纳米来衡量。

细菌的外部形态大多为球状、杆状、螺旋状，并且也因此命名为球菌、杆菌以及螺旋菌。而病毒为多面体结构，为了能达到最佳稳定结构，以及最佳比表面积，病毒多位一十二面体。

2.结构方面

虽然细菌没有细胞核只有类似的拟核结构，但是细菌仍具有一定的细胞结构，即细胞壁、细胞膜、细胞质。更进一步的，根据细菌细胞壁结构和成分的不同，发展出的革兰氏染色机制，将细菌分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。病毒不具有以上所述的细胞结构，它由核衣壳包裹遗传物质所构成。

3.生存繁殖方面

细菌根据其生存方式可以分为自养性和异样性，即一部分细菌可以通过光合作用（比如一些蓝藻Cyanobacteria）或者是将无机物转化成为有机物质的化能（比如一些硫细菌）方式而达到生存的目的；另一部分细菌则和人一样不能自己合成有机物质供自身的生长繁殖，必须从外界摄取营养来养活自己。病毒就没细菌那样能干了，它们只能依靠寄生于宿主（host）体内的形式而存活，当然这并不是说病毒完全不能脱离宿主，它们可以暂时脱离宿主，以休眠体的形式待在外 界对于它们而言非常“恶劣”的环境中。

在繁殖时细菌主要采用二分裂的方法，就是我们通常所说的一个变两，两变四的方式。病毒则必须侵入到宿主体内，利用宿主的合成机制来合成它们自己所需的蛋白质等物质来构建自己的“身体”。

细菌是微生物，而病毒是DNA(脱氧核糖核酸），与蛋白质一样，是由氨基酸合成的。 病毒、细菌在结构与感染的方式不同所产生的。病毒是一种非细胞形态的微生物，它体积小，小到高倍数的光学显微镜也看不到，只能用电子显微镜才能观察到。它无细胞器，由基因组核酸和蛋白质外壳组成。基因组仅含一种类型的核酸，或者是核糖核酸（RNA）或者是脱氧核糖核酸（DNA）。 在感染后的生存方式上，细菌与病毒有很大的区别细菌是单细胞生物。在人体内合适的条件下，如各种粘膜上就可能自我繁殖使人致病。只要改变细菌的繁殖条件就可能杀死细菌把病治好。而病毒则是非细胞微生物，缺乏完整的酶系统，不能独立进行代谢活动，因而不能像细菌一样进行自我繁殖。病毒感染后，先进入人体血液内，形成病毒血症。随后只能严格地寄生在人体靶细胞内，利用细胞的生物合成机器进行自身的复制并释放子代病毒。换言之，病毒只有进入了人体细胞内才能生存和复制，此时只要能识别病毒并能区分哪是被感染细胞哪是健康细胞，把病毒和被感染细胞杀死就能把病治好。可惜的是，到目前为止，现有的合成药物和治疗方法还不具备这种识别和区分功能，又不可能把人体所有细胞都杀死。而具备这种特异性识别功能的只有人体自身的免疫细胞和免疫球蛋白。如果感染者此时的免疫力低下，特异性抗体不足以清除病毒，病毒性疾病难治就是不言而喻的了。而且乙型肝炎病毒进入肝细胞后,它还可改变肝细胞膜的性质。使体内的免疫系统发生紊乱, 误把自身的肝细胞当做“敌人”来破坏, 而造成肝细胞损伤。即使你用抗病毒药物杀死了病毒,但自身的免疫功能仍会继续对肝细胞发生攻击。因此乙型肝炎比较难治愈, 除抗病毒治疗外, 还需进行免疫调节治疗。 细菌是一大类能独立生活的单细胞微生物，它们的新陈代谢就是从周围环境中摄取营养，以获得能量和合成自身组分的原料。细菌的表面积大，新陈代谢活跃且多样化，生长繁殖迅速。 细菌在代谢过程中不同菌可产生不同的代谢产物，有些产物对人有害，例如细菌产生的毒素和酶与其致病性有关；有些产物对人有利，例如细菌产生的维生素；有些产物对鉴别诊断细菌有作用，例如色素及糖分解产物等。一、细菌的营养 1．水分：占细胞浆的70%～90%，水是细胞的组成成分，也是良好的溶剂。 2．碳源（carbonsource）：碳源既是细菌的组成成分，又是细菌的能量来源。 3．氮源（nitrogensource）：氮是组成细菌蛋白质、酶和核酸的成分。 4．无机盐类：细菌所需无机盐包括磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、氯、锰、锌、钴、铜等。其中磷、硫、镁、钾、钠、铁需要量较多，其他只需微量。 5．生长因子（growthfactors）：生长因子是某些细菌生长所必需而其自身又不能合成的一类营养物质，包括维生素、嘌呤和嘧啶等。营养物质主要功用：①供给细菌所需要的碳源和氮源；②用以产生能量；③有的营养物如维生素主要用于调节新陈代谢。二、营养物质的吸收 1．扩散（diffusion）：是一种简单的吸收方式。受渗透压及溶质浓度的调节。 2．促进扩散（facilitated diffusion）：不需代谢能，不能逆浓度运输。需要载体蛋白参与。 3．主动运输（active transport）：细菌从低浓度向高浓度逆浓度梯度积累营养物质的过程称为主动运输。主动运输需要能量和透性酶或结合蛋白。 4．基团转位（grouptranslocation）：需要代谢能量主要存在于厌氧微生物中。葡萄糖、果糖等单糖以及核苷与脂肪酸的运输均以此种方式进行。三、细菌的营养类型 根据细菌对碳源利用情况的差异，可将细菌分为两大营养类型： 1．自养菌（autotrophicbacteria）：此类细菌能利用二氧化碳或碳酸盐作为唯一碳源。 2．异养菌（heterotrophicbacteria）： 需要利用有机物质碳作为营养和能源的细菌。异养菌又可以分为两类： （1）腐生菌（saprophytes）：有些异养菌能从无生命的有机物质中摄取营养。 （2）寄生菌：有些异养菌寄生于活的动植物体内，从宿主体内的有机物质中获得营养和能量，这类细菌称为寄生菌（parasites）。 大部分致病菌属于寄生菌。

1、细菌：原核生物的一种，主要特点是没有核膜，其遗传物质分散在细胞质内一个相对固定的区域内，称为核区。细菌的外边包裹着一层细胞壁，一般为多糖聚合而成。

2、病毒：构造很简单，外面是一层蛋白质，称为病毒外壳。蛋白质外壳内部包裹着病毒的遗传物质，可以是DNA，也可以是RNA。病毒自己不能完成新陈代谢，也不能完成繁殖，需要寄生在其它细胞内完成。

病毒和细菌的绝大部分是对人类没有害的，有害的只是很小的一部分。

有的病毒对人类是有益的，比方说烟草花叶病毒，是使植物烟草叶片感染的一种植物病毒，感染的烟草叶片象绣上了美丽的花纹。这种病毒用来进行转基因研究，对科学家帮助很大。

细菌也有很多是有益的。如人体大肠内寄生的大肠杆菌，帮助人类分解食物中的营养成分，可以给人体提供多种维生素。牛、羊等动物能够消化植物纤维，是因为他们的消化道内寄生了一种细菌，这种细菌可以分解纤维素；要是没有这种细菌的话牛和羊是没法吃草的。同时人们依靠细菌生产药品、食品、饲料、抗生素、味精、调料等。同时细菌也是大自然的分解者，分解动物的粪便、动植物的尸体等。没有细菌的世界是无法想象的世界，所有的生物将无法生存。

抗生素只能杀灭细菌。比方说青霉素，能破坏细菌细胞壁上的多糖，使细菌的表面暴露，失去了应有的保护作用，细菌也就不能生存了。病毒外部是蛋白质，抗生素对它们是没有作用的。但干扰素可以干扰病毒DNA或RNA的复制，使病毒的数量不再增加，然后依靠人体自身的免疫系统清除剩下的病毒。

F. 微生物的菌种鉴定方法与步骤(鉴定到 “ 株 “ 一级)

微生物的菌种鉴定方法主要可以分为以下几个步骤，直至鉴定到“株”一级：

一、样品采集与保存

首先，需要从待鉴定的微生物环境中采集样品。样品的采集需注意其代表性和无污染性。采集后，应按照微生物保存的要求，对样品进行妥善保存，以防止菌种发生变异或污染。

二、初步鉴定

初步鉴定主要通过微生物的形态学特征、培养特性以及生理生化特性进行。这些特性的观察和分析能够提供微生物的初步信息，如菌落的形态、颜色、大小等。

三、纯种分离

为了准确鉴定微生物，需要进行纯种分离。通过划线分离法、涂布分离法等方法，将微生物分散成单个菌落，以便进一步分析和鉴定。

四、生理生化特征分析

对纯种微生物进行生理生化特征的分析，包括菌株的生长曲线、酶活性测试、代谢产物的检测等。这些分析有助于确定微生物的种类和特性。

五、分子生物学鉴定

为了进一步确认微生物的种类，需要进行分子生物学鉴定。主要包括DNA提取、PCR扩增和序列分析。通过比对序列信息，可以确定微生物的种属。

六、鉴定到“株”一级

完成以上步骤后，根据形态学、培养特性、生理生化特性以及分子生物学鉴定的结果，综合判断并确定微生物的种属及亚型，即达到“株”一级的鉴定。每一株微生物都具有其独特的遗传信息和表型特征，是微生物菌种鉴定的重要目标。

总的来说，微生物的菌种鉴定是一个复杂且严谨的过程，需要借助多种方法和技术，结合微生物的特征和信息，逐步深入分析和判断，直至鉴定到“株”一级。这一过程对于了解微生物的多样性、研究微生物的生态学意义以及微生物的应用都具有重要意义。