盐酸检测蛋白质的方法

‘壹’ 蛋白质怎么检验(小学四年级上册)

运用凯氏定氮法
凯氏定氮法
原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4
反应式为：
2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）
2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中
反应式为:
(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4
2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O
3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量
反应式为：
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3
[编辑本段]2 试剂
所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 40%氢氧化钠溶液。
2.7 0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。
[编辑本段]3 仪器
定氮蒸馏装置：如图所示。
凯氏定氮法仪器1.安全管
2.导管
3.汽水分离管
4.样品入口
5.塞子
6.冷凝管
7.吸收瓶
8.隔热液套
9.反应管
10.蒸汽发生瓶
[编辑本段]4 操作方法
1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。
2、 按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
3、 向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
计算：
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%
X：样品中蛋白质的百分含量，g；
V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积），g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为 5.30。
[编辑本段]注意事项
（1） 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。
（3） 硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。
（4） 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
（5） 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。
（6） 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
（7） 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
（8） 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。
（9） 吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。
（10） 以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
（11） 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物[Cu(NH3)4]2+
（12） 这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。

‘贰’ 国家标准检测蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定方法就是检测N元素的含量，像三聚氰胺的问题，就是通过增加N的含量使“蛋白质”含量提高的。

国家标准检测蛋白质含量的方法叫做凯氏定氮法，食物中的蛋白质在催化加热条件下分解，导致氨和硫酸结合产生硫酸铵。 碱蒸馏采用无硫，硼酸吸收，用硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸耗计算氮含量，再乘以转化系数，即蛋白质含量。

具体操作步骤如下：

1.样品处理

精确称量0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸收10-20ml液体样品（约30-40mg氮当量）。将其转移至干燥的100毫升或500毫升氮气固定瓶中，加入0.2克硫酸铜，6克硫酸钾和20毫升硫酸，轻轻摇动，在瓶口放置一个小漏斗，将瓶子倾斜石棉网上有45度角，有小孔。

加热小火后，内容物碳化，泡沫完全停止，加强火力，保持瓶内液体稍微沸腾，直至液体呈蓝绿色澄清透明，然后继续加热0.5小时。取出并冷却，小心加入20毫升水，冷却，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗净氮气瓶，洗净液放入容量瓶中，然后用水冲洗至刻度，混匀备用。

取相同量的硫酸铜，硫酸钾和浓硫酸作为试剂进行空白试验。然而，这种方法很危险，很难在实验室中证明。大多数实验室都有一个消化器，可以一次处理16个以上的样品和一个可以自行设定温度的呼吸机。它更安全，更可操作。

(2)盐酸检测蛋白质的方法扩展阅读

除了凯氏定氮法以外，标准的测量方法还有：

• 分光光度法

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量,结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。

• 燃烧法

样品在900~1200℃下燃烧。在燃烧过程中，产生混合气体。 诸如碳，硫和盐的干扰气体被吸收管吸收，氮氧化物被还原成氮。 形成的氮气流由热导检测器（TCD）检测。

‘叁’ 蛋白质含量测定的标准方法

测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。常见的方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、酚试剂法及紫外吸收法。
1.凯氏定氮法
准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化，之后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。
2.双缩脲法
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。首先利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并用只加入硫酸钠不含血清的试管作为对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，充分混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，由标准曲线上直接查出蛋白质含量。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。
3.酚试剂法
取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值
4.紫外吸收法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

‘肆’ 如何准确测定样品中蛋白质的含量

5种方法测定蛋白质含量

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

二、双缩脲法（biuret法）

1、实验原理

双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

2、试剂与器材

（1）试剂：a、标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用0.9%nacl配制，酪蛋白用0.05n nach配制。

b、双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜和6.0克酒石酸钾钠，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

（2）器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。

用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

（2）样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

三、folin—酚试剂法（lowry法）

1、实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。

在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

2、试剂与器材

（1）试剂

a、试剂甲： （a）10克碳酸钠，2克 naoh和0.25克酒石酸钾钠 。溶解于500毫升蒸馏水中。 （b）0.5克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。

b、试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠，25克钼酸钠及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，

开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准nach滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。

c、标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%nacl溶液。

（2）器材

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、秒表

d、试管16支

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，

然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。

这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。

全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。

每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

folin—酚试剂法实验表 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6 （约250mg/ml）

蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量（mg） 吸光度值（a700）

（2）样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。

通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易folin—酚试剂法

1、试剂

（1）试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n 氯化钠、10%碳酸钠、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

（2）试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

（3）标准蛋白质溶液：同基本法。

2、操作步骤 测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。

用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与 folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。

五、考马斯亮兰法（bradford法）

1、实验原理 双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

2、试剂与器材

（1）试剂：

a、标准蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

b、考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

（2）器材：

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、试管16支

3、操作方法

（1）标准方法

a、取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。

最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

b、加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1ml水加5.0mg—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)

蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量（mg） 光吸收值 （a595）

c、用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。

（2）微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml水，考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。

‘伍’ 食品中蛋白质含量怎么测

目前食品中蛋白子含量的测定通常采用凯氏定氮法。

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

凯氏定氮法检测的是粗蛋白，原理是检测其中的氮含量，因为氮含量在真蛋白中大约 是16%左右，倒数就是6.25，所以，检测出氮含量后，乘以6.25就是粗蛋白含量了。

凯氏定氮法的缺点是把非蛋白中的氮也算进去了，所以，才会有前几年出现的三聚氰胺的事件，三聚氰胺是非蛋白氮，用凯氏定氮法检测时，也把它算进去了，这就是奶粉造假的依据。

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‘陆’ 测蛋白质的含量

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）
（5009．5-2003食品中蛋白质含量测定）
一、目的与要求
1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理
蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
三、仪器与试剂
（一）试剂
1、硫酸铜（CuSO4•5H20）
2、硫酸钾
3、硫酸（密度为1.8419g/L）
4、硼酸溶液（20g/L）
5、氢氧化钠溶液（400g/L）
6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。
7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。
8、黄豆粉。
（二）仪器
微量定氮蒸馏装置：如图3- 所示。

图3- 微量凯氏定氮装置
1、电炉； 2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；
4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；
7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。
四、实验步骤
1、样品消化
称取黄豆粉约0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
2、定氮装置的检查与洗涤
检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。
测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。
3、碱化蒸馏
量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂2~3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a关闭，螺旋夹b开启的状态下，准确吸取10.0mL样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。使10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a，关闭螺旋夹b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。
同时吸取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操作。
4、样品滴定
以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。
5、数据记录
项 目 第一次 第二次 第三次
样品消化液（mL）
滴定消耗盐酸标准溶液（mL）
消耗盐酸标准溶液平均值（mL）
五、结果计算

式中 X——样品蛋白质含量（g/100g）；
V1——样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；
V2——空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；
c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；
0.0140 ——1.0mL盐酸 标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；
m——样品的质量（g）；
F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；
高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为
6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。
计算结果保留三位有效数字。
六、注意事项及说明
1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）。若检测液体样品，结果以g/100mL表示。
2、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。
3、消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。
4、硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。
5、在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%
七、思考题
1、预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作。
2、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？
3、在蒸汽发生瓶水中、加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸的作用是什么？若在蒸馏过程中才发现蒸汽发生瓶中的水变为黄色，马上补加硫酸行吗？
4、实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？

‘柒’ 常用来测定蛋白质含量的方法有哪些优缺点是什么

1、凯氏定氮法

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。

由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

优点：可用于所有食品的蛋白质分析中；操作相对比较简单；实验费用较低；结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。

缺点：凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。

当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。

优点：测定速度较快，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

缺点：①灵敏度差； ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

3、酚试剂法

取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效。

缺点：①费时，要精确控制操作时间；②酚法试剂的配制比较繁琐。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。 

缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差； ②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

5、考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。

在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。

缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

‘捌’ 饲料中真蛋白的检测方法，尽可能详细说明步骤

饲料中纯蛋白质的测定 一、测定原理 硫酸铜在碱性溶液中，可将蛋白质沉淀，且不溶于热水，过滤和洗涤后，可将纯蛋白质和非蛋白质含氮物分离，再用凯氏定氮法测定沉淀中的蛋白质含量。 二、仪器设备 （1）烧杯：200mL。 （2）定性滤纸。 （3）其它设备与粗蛋白质测定性相同。 三、试剂及配制 （1） 100g/L硫酸铜溶液：分析纯硫酸铜（CuSO4 5H2O）10g溶于100mL水中。 （2） 25g/L氢氧化钠溶液：将2.5g分析纯氢氧化钠溶于100mL水中。 （3） 10g/L氯化钡溶液：1g氯化钡（BaCl2 H2O）溶于100mL水中。 （4） 2mol/L盐酸溶液。 （5） 其它试剂与一般粗蛋白质测定法相同。 四、测定步骤 准确称取试样1g左右（精确至0.0001g），置于200mL烧杯中，加50mL水，加热至沸，加入20mL硫酸铜溶液，20mL氢氧化钠溶液，用玻璃棒充分搅拌，放置1小时以上，用倾斜过滤（用定性滤纸），然后用60-80℃热水洗涤沉淀5-6次，用氯化钡溶液5滴和盐酸溶液1滴检查滤液，直到不生成白色硫酸钡沉淀为止。将沉淀和滤纸放在65℃烘箱干燥2小时，然后全部转移到凯氏烧瓶中，消化后进行氮测定。 五、结果计算 同粗蛋白质测定。

‘玖’ 蛋白质及氨基酸的测定有哪些方法求大神帮助

楼主你好： 测定蛋白质最基本的方法是定氮法，即先测定样品中的总氮量，再由总氮量计算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。此外，双缩脉法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 蛋白质及氨基酸的测定 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体内的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；物质的代谢及转运都与蛋白质有关。人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养指标。 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。蛋白质可以被酶、酸或碱水解，最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病，或通过补充而增强了新陈代谢作用。所以食品及其原料中蛋白质和氨基酸的分离、鉴定和定量具有极其重要的意义。 蛋白质的测定 测定蛋白质最基本的方法是定氮法，即先测定样品中的总氮量，再由总氮量计算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。此外，双缩脉法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 微量凯氏定氮法 本法适用于各类食品中蛋白质的测定。 1．原理 食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸胺。然后碱化蒸馏使氨游离，用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。反应过程分为三个阶段，用反应式表示如下。 ①消化 2NH2(CH2)2COOH 4-13H2S04一(NH。)2S04+6C02+12S0=+16H20 (NH4)2S04+2Na()H一2NH3十+2H20+。Na2S04 2NH3+4H3803—，(NH4)2 B207+5H20 ③滴定 (NH4)2 B2 07+2HCl+5H20—NH4C1+4H3803 2．仪器 ①消化炉。 ②凯氏定氮蒸馏装置。 3．试剂 所用试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。 ①CuS04。 ②K2SO。 ③浓H2SO。 ④2％H。BO。溶液。 ⑤混合指示剂：1份O．1％甲基红乙醇溶液与5份O．1％溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份O．1％甲基红乙醇溶液与1份0．1％次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 ⑥饱和氢氧化钠：500 g氢氧化钠加入500 mL水中，搅拌溶解，冷却后放置数日，澄清后使用。 ⑦0．01 toolI．一’或0．05 toolL叫HCl标准溶液(需用无水碳酸钠标定后使用)。 4．操作步骤 ①样品消化：精密称取O．2～2．0 g固体样品或2～5 g半固体样品或吸取液体样品5～20mI。，放人500 mI。干燥凯氏烧瓶中，加人O．2 g硫酸铜、3 g硫酸钾及20 mL浓HzSOa，于凯氏瓶口放一小漏斗，并将其以45。角斜支于有小孔的石棉网上。（更多详细咨询请参考国家标准物质网 www.rmhot.com ）用电炉以小火加热，待内容物全部碳化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变蓝绿色透明后再继续加热微沸30 min。冷却，小心加入20 mL水，再放冷至室温，移人100 mL容量瓶中，并用少量水洗烧瓶洗液并人容量瓶，在加水至刻度，混匀备用。除不加样品外，取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸，按同一方法做试剂空白消化。 ②水蒸气发生瓶内装水至约2／3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 ③向接收瓶内加入10 mL 2％硼酸溶液及混合指示液l滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取lO mI。样品消化稀释液由小玻璃杯流人反应室，并以10 mL水洗涤小烧杯使之流人反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将3～10 mL饱和氢氧化钠溶液倒人小玻璃杯中，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻璃塞盖紧，并加水于小玻璃杯中以防漏气。加紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸汽通人反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏2～5 min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，然后用少量中性水冲洗冷疑管下端外部，再蒸馏1 min取下接收瓶，以0．01 molI．叫或O．05 molL1HCl标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10 mI_，试剂空白消化液按③操作。 5．计算 6。说明 ①干样用称量纸称重连纸一同消化，空白管同样放称量纸消化。 ②含糖量高和油脂高的样品消化时容易溢出，加热要缓慢。 ③氨是否蒸馏完全，可用pH试纸测试馏出液是否为碱性来判断。 ④实验前必须仔细检查蒸馏装置的各个连接处，保证不漏气。所用橡皮管、塞子须浸在氢氧化钠(10％)中，煮沸10 min，然后水洗、水煮，再用水洗。 ⑤小心加样，切勿使样品沾污凯氏烧瓶口部和颈部。