如何建立液相方法

Ⅰ 如何建立高效液相色谱法测定含量的方法

1色谱条件的确定专属性是色谱条件建立的关键通常是采用在被测物对照品(或供试品)中加入适量的杂质或辅料以验证所选色谱条件能否将各杂质与被测物分离检出

Ⅱ 如何建立高效液相色谱法测定有关物质的方法

摘要 本文就如何建立TLC法测定有关物质的方法进行论述，系统地阐述了薄层色谱法各条件确定的原理，并列举了质量标准制订中存在的某些问题。
关键词 薄层色谱法（TLC法） 有关物质 方法建立
有关物质是研究药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、降解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程中产生的降解物，或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物等[1]。这些杂质的存在直接反映药品的有效性和安全性，故要对其进行研究，特别是在药品申报的质量研究资料中需建立其检测方法，并根据生产、稳定性考核等实际情况考虑是否在质量标准中制订该检查项，规定其限度。目前，有关物质的常用测定方法有高效液相色谱法(HPLC法)和薄层色谱法(TLC法)。
TLC的特点是快速、简便，尤其是对无紫外吸收的杂质测定，更具有其应用价值。如能将TLC法与HPLC法有机地结合、或彼此间进行比对研究，便可得到更多、更为准确的有关杂质信息，做到两方法间的相辅相成，相益得彰！本文将着重讨论如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法。
1．测定方法类型
常用的方法有杂质对照品法（适用于已知杂质）和自身（稀释）对照法（适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得杂质对照品）。目前国内由于难以获得杂质对照品、故一般均采用自身对照法。
2．展开剂的确定（即专属性试验）
专属性的研究是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，该点是色谱条件建立的关键。通常采用在被分析物的对照品或精制品中加入一定量的杂质或辅料，证明色谱条件可将各杂质与被分析物分离[1]。这里的关键是：将多少量的杂质加入到多少量的主成分中。正确的作法是将1%(w/w)浓度量的各杂质加入到100%浓度的主成分中，配制这样的溶液来
验证系统适用性。

Ⅲ 如何进行液相分析方法开发

如何进行液相分析方法开发
一、方法验证简介
分析方法开发与验证是一个整体，在实际工作中，一般是先开发分析方法，经过适当的优化以后再做方法验证。所谓方法验证是指为了保证分析检测结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的准确性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合分析测试的目的和要求。方法验证在质量控制上有重要的作用和意义，在建立产品质量标准时，分析方法需经验证；在产品生产工艺变更、配方的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。

二、方法验证内容包括
专属性、线性、范围、准确度、精密度、检出限、定量限、耐用性等。

三、方法验证成熟仪器项目
色谱类仪器：气相色谱/质谱联用仪GC/GC-MS、液相色谱/质谱联用仪LC/LC-MS、三重四级杆串联液质仪UPLC-MS-MS；
元素类仪器：电感耦合等离子发射光谱/质谱联用仪ICP-OES、电感耦合等离子发射光谱/质谱联用仪ICP-MS、离子色谱仪IC、原子吸收光谱仪AAS、原子荧光光谱仪AFS。

四、方法验证成熟分析项目
鉴别试验、杂质定量检查或限度检查、微量助剂（如增塑剂、抗氧剂等助剂）的测定、有效成分含量测定、溶剂残留、元素测定、离子测定等。

Ⅳ 如何建立高效液相色谱法测定含量的方法

1 色谱条件的确定
专属性是色谱条件建立的关键通常是采用
在被测物对照品(或供试品)中加入适量的杂质或辅
料以验证所选色谱条件能否将各杂质与被测物
分离检出
[2]
。应按1(w/w)被测物浓度的各杂质量
添加至被测物中模拟被测物中可能存在杂质的
状态即有少量(约1)杂质存在时能否与被测物
达到完全分离(分离度大于1.5)以验证系统适用
性。只有这样才能较为客观、科学地反映被测物的
实际情况。而不应将被测物与各杂质配制成相同浓
度的溶液因为实际检测中不可能存在这种情况
且该浓度也不易确定。在实际检测时由于被测物
浓度较大很易将相邻杂质峰包含其中。另外还需
测定溶剂和辅料(检测制剂时)是否有干扰。目前
美国药典(USP)、英国药典(BP)及许多进口产品的
质量标准中有关物质测定方法学的专属性验证均
采用此法。还须说明的是杂质与杂质峰间的分离
度达1.2即可而被测物与其相邻杂质峰的分离度
必须大于1.5。
2 检测波长的选择
有关物质检测的研究对象是杂质而非被测
物。但测定则是通过各自的峰面积来表达故波长
的选择必须考虑被测物和各杂质在检测波长下的校
正因子(f)是否相同。应分别制备相同浓度的被测
物与各杂质溶液经紫外扫描后以吸光度相近的波
长为检测波长。在该检测波长下分别进样测定
由各峰面积计算校正因子。若f为0.81.2则表明
被测物与各杂质的f相同可消除f的影响。若f≤0.8
或f ≥1.2则应在计算时加入f。目前通常以被测物
的最大吸收波长为检测波长、不加校正因子的计算
方法而未综合考虑各杂质的f。
3 供试品溶液浓度的确定
供试品溶液浓度的确定也非常重要。虽然浓度
越高越能反映被测物中杂质存在的情况但若设定
过高会产生主峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况若设定过低则灵敏度不够无法
检测杂质及其含量变化。
最低检出浓度的测定可分为信噪比法和直接评
价法两种
[3]
。后法是目前较为科学的做法即将仪
器的灵敏度调至较适宜的值(仅对灵敏度可调节的
仪器而言目前市场上主流品牌的液相色谱仪均已
设定了一个恒定、较为灵敏的值)然后将被测物
溶液不断稀释后进样测定直至被测物峰面积无法
检出为止此时的浓度即为最低检出浓度。
最大进样量则是采用不断增加被测物溶液浓
度直至峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载
等情况出现。
根据最低检出浓度采用“上推法”来确定
供试品溶液浓度如一般设定杂质总量小于1.0
对照液对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度的
2050倍供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的
20005000倍。同时还应考虑仪器、色谱柱等因
素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响(即耐用
性因素)所以供试品溶液的浓度应在保证小于最
大进样量的情况下适当设定得高些以保证该浓
度在任何试验条件下均有足够的检测灵敏度。表
1为最低检出浓度、最大进样量、供试品溶液和对
照溶液间的比例关系(进样量10µl规定杂质限度
1.0)。
4 线性试验
在稳定性考察中如某杂质含量不断增加
则说明被测物降解的途径稳定、可循则有必要对
该杂质进行针对性地监控即采用该杂质对照品
(经确证结构后由人工合成获得)以外标法准确测
定。此时与含量测定相似应进行线性试验。
通常将杂质限度设定为该杂质的100浓度线性
验证范围10150(即相当于被测物测定浓度
表1 最低检出量、最大进样量、供试品溶液和对照
溶液间的比例关系
参数浓度/µg·ml
–
1
绝对量/ng相当于供试品
溶液浓度/与最低检出
浓度的倍数
最大进样量3000
最低检出浓度0.110.02
供