菌落的测定方法和步骤

Ⅰ 食品中细菌总数和菌落总数是怎么样测定的

食品中细菌总数和菌落总数的测定方法如下：

平板培养计数法

实验方法原理

菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1 g或1 ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 实验材料

琼脂培养基 食品检样

试剂、试剂盒

乙醇生理盐水氢氧化钠溶液

仪器、耗材

电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托盘、天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、均质器、乳钵、灭菌刀、剪刀、灭菌镊子、酒精、棉球、玻璃、蜡笔、登记薄

实验步骤

一、检验程序

菌落总数检验程序见图5—1

二、检样稀释及培养

1. 以无菌操作，将检样25 g(或25 mL)剪碎以后，放于含有225 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预先置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8 000 r／min—1 0000 r／mln的速度处理1 min做成1：10的均匀稀释液。

2. 用1 mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1 mL，沿管劈徐徐注入台有9 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同)，振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。

3. 另取1 mL的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1 mL灭菌吸管。

4. 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。

5. 稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基[可放置在(45土1) ℃水浴锅内保温注入平皿15 mI一20 mL，并转动平皿位混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1 mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。

6. 待琼脂凝固后，翻转平板，置(36土1) ℃恒温箱内培养(48土2) h取出板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得I g(1 mL)样品所含菌落总数。

注意事项

1. 平板培养计数法只能检出生长的活菌，不能检出样品中全部的细菌数，总是比实际生存在食品中的细菌数要少，这是因为食品中存在多种细菌，它们的生活特性各异，不可能在统一培养条件下全部生长出来。但是，仍能借此评定整个食品被细菌污染的程度，所以目前一般食品的卫生检验中都普遍采用这种方法。

2. 平板菌落计数测定食品中的菌落总数，一般均采用中温培养，特别是已属于直接供食用的制成食品，因为这些食品卫生的要求，是严格防止消化道传染病病原菌和食物中毒病原菌污染，这些病原菌都属于嗜温性菌，因而测定细菌数时，采用中温培养是比较合理的。

Ⅱ 菌落总数大肠杆菌和致病菌的检测方法

大肠菌群测定的操作细则
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1
设备和材料
1.1
温箱：36±1℃。
1.2
冰箱:0～4℃。
1.3
恒温水浴
:44.5±0.5℃。
1.4
天平。
1.5
显微镜。
1.6
均质器或乳钵。
1.7
平皿:直径为90mm。
1.8
试管。
1.9
吸管。
1.10
广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11
玻璃珠:直径约5mm。
1.12
载玻片。
1.13
酒精灯。
1.14
试管架。
2
培养基和试剂
2.1
乳糖胆盐发酵管:按GB
4789.28中4.9规定。
2.2
伊红美蓝琼脂平板:按GB
4789.28中4.25规定。
2.3
乳糖发酵管:按GB
4789.28中4.10规定。
2.4
EC
肉汤:按GB
4789.28中4.11规定。
2.5
磷酸盐缓冲稀释液:按GB
4789.28中3.22规定。
2.6
生理盐水。
2.7
革兰氏染色液:按GB
4789.28中2.2规定。
3
操作步骤
3.1
检样稀释
3.1.1
以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8
000-10
000
r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2
用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3
另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4
根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
3.2
乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖
胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃
温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3
分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃
温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4
证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置
36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5
报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
4
粪大肠菌群(faecal
coliform)
4.1
用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置
培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2
结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。

Ⅲ 微生物平板菌落计数法具体实验步骤

一、目的要求

学习平板菌落计数的基本原理和方法。

二、基本原理

平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的,也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时,先将待测样品作一系列稀释,再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基内,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可换算出样品中的含菌数。

这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定(如杀虫菌剂),生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁,而且测定值常受各种因素的影响。

三、器材

大肠杆菌悬液,牛肉膏蛋白胨培养基, 1ml无菌吸管,无菌平皿,盛有4． 5 ml无菌水的试管,试管架和记号笔等。

四、操作步骤

1．编号：

取无菌平皿 9套,分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml无菌水的试管,排列于试管架上,依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2．稀释

用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中,注意吸管尖端不要碰到液面,以免吹出时,管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次,吸时伸入管底,吹时离开水面,使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸0．5ml放入10-2试管中,吸吹三次,……其余依次类推。整个稀释过程如图Ⅷ-3。

3．取样

用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml,对号放入编好号的无菌培养皿中。

4．倒平板

于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中,倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml,置水平位置,迅速旋动混匀,待凝固后,倒置于37℃温室中培养。

5．计数

培养24小时后,取出培养皿,算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数,并按下列公式进行计算：

每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊,如相差较大,表示试验不精确。

平板菌落计数法,所选择倒平板的稀释度是很重要的,一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

平板菌蓓计数法的操作除上述的以外,还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同,所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板,待凝固后编号,并于 37℃温室中烘烤30分钟左右,使其干燥,然后用无菌吸管吸取 0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上,再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀,平放于实验台上20—30分钟,使菌液渗透入培养基内,然后再倒置于37℃的温室中培养。

五、实验报告

1．结果

将计数结果填入下表。

2．思考题

(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？

(2)要使平板菌落计数准确,需要掌握哪几个关键？为什么？

(3)同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数,所得结果是否一样？为什么？

(4)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。

Ⅳ 菌落总数的检测

平皿计数法

菌落总数(standardplate-countbacteria):水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。

仪器和装置

高压蒸汽灭菌器。

干热灭菌箱。

培养箱(36±1)℃。

电炉。

冰箱。

放大镜或菌落计数器。

pH计或精密pH试剂。

灭菌试管。

平皿直径9cm。

培养基与试剂

营养琼脂成分蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂10～20g、蒸馏水1000mL。

制法将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4～7.6，分装于玻璃容器中(如用含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经103.43kPa(121℃)灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

检验步骤

1)水样处理。

a.饮用水。以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入来菌平皿中，倾注约15mL已熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。

待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于(36±1)℃培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为1mL水样中的菌落总数。

b.水源水。以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1∶10稀释液。

吸取1mL1∶10的稀释液注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1∶100稀释液。按同法依次稀释成1∶1000、1∶10000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1mL灭菌吸管。

用灭菌吸管取未稀释的水样和2～3个适宜稀释度的水样各1mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。

2)菌落计数及报告方法。作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。

不同稀释度的选择及报告方法:

首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例1)。

若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视二者之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数(如表82.2中实例2)。若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数(如表82.2中实例3)。若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数(见表82.2中实例4)。

若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例5)。

若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例6)。

若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表82.2中实例7)。

若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。

如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm²中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿度面积63.6cm²，再乘其稀释倍数作报告。

菌落计数的报告:菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字;在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示(见表82.2“报告方式”栏)。

表82.2 稀释度选择及菌落总数(CFU)报告方式

Ⅳ 菌落总数的检测方法步骤有哪些

菌落总数的检测方法可以用北 京美正生物的菌落总数测试片测试，只需3步，就可实现快速准确的测定！AC的计数结果对比传统方法，操作简单快捷，节约时间，节约成本。

Ⅵ 菌落计数有哪些的方法

测定微生物细胞数目方法有多介绍几种

1.血细胞计数法

稀释菌液样品滴血细胞计数板上显微镜下计算4~5格细菌数并求出每小格所含细菌平均数再此依据估算总菌数

①此法缺点能区分死菌和活菌

②对压小方格界线上细菌应当取平均值计数

③此法用于测定培养液酵母菌种群数量变化

2.稀释涂布平板法

原理：每活细菌适宜培养基和良好生长条件下通过生长形成菌落培养基表面生长菌落来源于样品稀释液活菌

①方法常用来统计样品活菌数目

②统计菌落数往往比活菌实际数目低原因当两活多细胞连起时平板上观察只菌落因此统计结般用菌落数而用活菌数来表示

③土壤、水、牛奶、食品和其材料所含细菌、酵母、芽孢与孢子等数量均用此法测定适于测定样品丝状体微生物例放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等营养体等

④此法若培养成菌落通过定量菌液均匀地涂布玻片上定面积上经固定染色显微镜下计数样又称涂片计数法染色用台盼蓝台盼蓝能使死细胞染成蓝色分别计数死细胞和活细胞

3.滤膜法

滤膜法当样品菌数低时定体积湖水、海水或饮用水灯样品通过膜过滤器滤膜干燥、染色并经处理使膜透明再显微镜下计算膜上（或定面积上）细菌数

此法也通过培养观察形成菌落数来推算样品菌数例测定饮用水大肠杆菌数目：已知体积水过滤滤膜放伊红美蓝培养基上培养该培养基上大肠杆菌菌落呈现黑色根据培养基上黑色菌落数目计算出水样大肠杆菌数目

此法也统计样品活菌数目

4.比浊法

原理定范围内菌悬液细胞浓度与混浊度成正比即与光密度成正比菌越多光密度越大因此借助与分光光度计定波长下测定菌悬液光密度光密度表示菌量实验测量时定要控制菌浓度与光密度成正比线性范围内否则准确

5.显微镜直接计数法

课本生物选修1生物技术实践P22除了上述活菌计数法外显微镜直接计数也测定微生物数量常用方法里说显微镜直接计数我认应该稀释涂布基础上培养成菌落而通过染色方法显微镜下直接计数再滤膜法也样有两种情况

另外微生物计数法发展迅速多种多样快速、简易、自动化仪器和装置等方法用来统计微生物数目。

来源：http://..com/link?url=ZF7Dq5chhYTeO1xK

Ⅶ 菌落总数测定

菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，从每个稀释液中分别取出1毫升置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合。

在一定温度下，培养一定时间后，一般为48小时。记录每个平皿中形成的菌落数量。依据稀释倍数，计算出每克原始样品中所含细菌菌落总数。

操作分析

基本操作一般包括：样品的稀释、倾注平皿、培养48小时、计数报告。国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同。

只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。

Ⅷ 美正菌落总数的测定方法有哪些

美正的菌落总数测试片是为预制型培养基系统，适合于各类食品、食品原料及生产环境中菌落总数的测定。检测步骤是参照GB 4789.2-2016，取样品 25g（mL）放入含有225 mL无菌磷酸盐缓冲液（或无菌生理盐水）的无菌均质杯或均质袋内，均质后，制成1:10样品匀液，吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，混匀后成为1:100的样品匀液，以此类推，制备10倍系列稀释样品匀液，每稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。根据样本的卫生状况选择2~3个适宜的稀释度进行接种检测（液体样品也可包括原液）▪⋅

Ⅸ 如何做菌落检测

菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。
检验方法参见：
GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》
SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品菌落计数》
三、说明
（一）样品的处理和稀释：
1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液
的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。
2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。
在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。
5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。