卡那黴素紫外檢測方法

Ⅰ 有關ECAP的論文

聯合應用卡那黴素和速尿的豚鼠耳蝸毒性實驗觀察
【摘要】 目的 探討卡那黴素和速尿聯合用葯對豚鼠耳蝸的毒性作用。方法 實驗組25隻豚鼠先行肌肉注射卡那黴素500 mg/kg，2小時後靜脈注射速尿50 mg/kg，對照組4隻豚鼠。於葯物注射後7天行聽覺腦干誘發電位（ABR）儀檢測試驗組和對照組豚鼠耳蝸聽功能，對閾值大於95 dB SPL豚鼠行耳蝸鋪片免疫熒光染色和常規切片觀察，並對耳蝸進行掃描電鏡觀察。結果 實驗組25隻豚鼠中有13隻豚鼠ABR測試閾值高於95 dB SPL，將這些致聾豚鼠作為觀察對象，發現毛細胞和神經纖維明顯受損，以耳蝸第一、二回損傷明顯。結論 卡那黴素和速尿聯合用葯可導致豚鼠毛細胞和神經纖維嚴重受損，是建立耳聾模型的一種快速而有效的方法。

【關鍵詞】 卡那黴素 速尿 聽覺腦干誘發電位 耳蝸 組織病理學 免疫熒光

【Abstract】 Objective To investigate the ototoxicity of co-administration of kanamycin（KM） with the loop diuretic furosemide to guinea pigs. Methods Guinea pigs received an intramuscular injection of KM（500 mg/kg） followed 2h later by an intravenous infusion of furosemide（50 mg/kg）. Auditory brainstem responses（ABRs） were recorded to monitor the animals' hearing at the 7th day after the drug administration. Immunohistochemical and histopathological changes were observed by using light micros and scanning electron micros. Results Subsequent ABR monitoring showed that profound hearing loss was both bilateral and permanent. Histopathological examination showed an absence of all inner and outer hair cells in the basal cochlea. The extent of neurofiber lesion was also eveident at the basal cochlea and dependent on the period of survival following the deafening procere. Conclusion The co-administration of KA and furosemide effectively proces a profound hearing loss in guinea pigs and it is an effective deafening method for acute animal experiments.

【Key words】 kanamycin（KM）; Furosemide; Auditory brainstem responses（ABRs）;; Cochlear histopathology

聯合應用肌肉注射卡那黴素（kanamycin，KM）和利尿酸（ethacrynic acid，EA）進行動物耳聾造模具有單次給葯誘導耳聾而不必刺激耳蝸或者圓窗的優點〔1〕。卡那黴素是氨基糖甙類抗生素，其內耳毒性臨床和試驗研究已有不少報道；速尿是袢利尿劑，速尿耳毒性的試驗研究表明〔2〕其能使血管紋邊緣細胞產生病變，我們的前期實驗採用聽性腦干反應（ABR）等項檢測證明，在KM和EA聯合用葯後三天，豚鼠聽功能即嚴重受損〔3〕。本研究利用冰凍切片、耳蝸鋪片琥珀酸脫氫酶(SDH)染色法、免疫熒光染色和掃描電鏡觀察技術，從內耳病理形態學方面評價卡那黴素和速尿聯合應用對豚鼠耳蝸的毒性作用。

1 材料和方法

1.1 動物分組

選用耳廓反應靈敏的健康成年白色紅目豚鼠29隻，雌雄不限，體重250 ～ 300 g（由解放軍總醫院實驗動物中心提供），隨機分成兩組,實驗組25隻,空白對照組4隻。

1.2 動物用葯

實驗組豚鼠先給予硫酸卡那黴素 500 mg/kg大腿內側肌肉注射一次，2小時後給予速尿靜脈注 射：先用速眠新0.01 ml /kg大腿內側肌肉注射麻醉動物，手術暴露一側頸靜脈，按50 mg/kg於30秒鍾內將速尿注入〔3〕。

硫酸卡那黴素：25萬單位/ ml，天津葯業焦作有限公司生產， 批號： 06051531； 速尿：10 mg/ml，天津金耀氨基酸有限公司生產，批號：0606191。速眠新：1.5 ml，解放軍軍需大學畜牧研究所提供，主要成分為氟哌啶醇、新眠靈、氯胺酮。

1.3 聽性腦干反應（ABR）閾值測試

兩組豚鼠均於用葯後7天應用美國智聽公司Intelligent Hearing System Smart EP2.22 系統, 在隔聲屏蔽室內行雙側ABR閾值測試。刺激聲用短純音（tone burst），帶通濾波寬度為300 ～ 3 000 Hz，疊加次數1 024次，掃描時間10 ms。電極設置為：顱頂為記錄電極，耳為參考電極，地極置入鼻尖。 短純音2 kHz， 4 kHz， 8 kHz，16 kHz作為刺激音。

1.4 標本制備

斷頭取出顳骨，打開聽泡，在耳蝸頂部鑽一小孔，同時打開橢圓窗和圓窗；再用吸管從蝸尖小孔向耳蝸內灌入4% 多聚甲醛固定液，至液體從兩窗流出,然後將顳骨浸入固定液浸泡固定。取實驗組ABR閾值大於95 dB SPL的8隻豚鼠耳蝸和對照組3隻耳蝸做常規冰凍切片，實驗組ABR閾值大於95 dB SPL的14隻豚鼠耳蝸和對照組3隻耳蝸進行全耳蝸基底膜鋪片免疫熒光染色，取試驗組ABR閾值大於95 dB SPL的4隻豚鼠耳蝸和對照組2隻豚鼠耳蝸制備掃描電鏡樣品。

1.5 免疫熒光組織化學染色

耳蝸鋪片標本用0.01 mol/L磷酸緩沖液（PBS）洗三遍。0.1% Triton-PBS浸泡三分鍾。10% 羊血清（稀釋於0.01% Triton-PBS）室溫封閉30分鍾，傾去羊血清封閉液勿洗。加入一抗兔來源MyosinVI抗體和鼠來源Neurofilament抗體（SIGMA生物技術公司）， 用3% 羊血清Triton-PBS稀釋， 4℃ 冰箱過夜。 0.1% Triton-PBS洗10分鍾各三次。加入二抗（熒光染料Alexa Flour 488標記的羊抗兔和羊抗鼠IgG抗體）， 室溫下避光孵育一小時。PBS洗10分鍾各三次。防淬滅劑封片。激光掃描共聚焦顯微鏡（Zeiss， LSM 510 Meta， 德國）下觀察。

1.6 掃描電鏡樣品制備

耳蝸組織取出後，所有樣品用戊二醛和四氧化鋨固定，2% 單寧酸導電染色，梯度乙醇脫水。醋酸異戊酯過度，樣品的乾燥用日立公司生產的HCP-2型臨界點乾燥儀，E-102型真空離子濺射儀進行鍍膜後，用S-4800型掃描電子顯微鏡觀察並拍攝照片。
2 結 果

2.1 組織形態學觀察

由於個體差異，豚鼠對葯物敏感性不同，25隻實驗組豚鼠中有13隻用葯1周後ABR閾值大於95 dB SPL，這些嚴重致聾的豚鼠耳蝸掃描電鏡觀察可見第一、二回內外毛細胞靜纖毛散亂、融合，甚至毛細胞全部被瘢痕替代（圖1）。致聾豚鼠耳蝸切片光鏡觀察，可見耳蝸毛細胞嚴重受損，以外毛細胞損傷為主，第一、二回耳蝸毛細胞損傷比第三、四回嚴重，有的豚鼠毛細胞嚴重損傷，切片發現內毛細胞也廣泛缺失（圖2）。

2.2 免疫熒光組織學觀察

對用葯後不同時間點的ABR閾值大於95 dB SPL的5隻豚鼠10耳進行基底膜鋪片免疫熒光染色，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察發現，與正常對照相比，除用葯後1周的1隻豚鼠雙耳神經纖維大致正常外，用葯後1周的1隻豚鼠和用葯後3周的2隻豚鼠及用葯後4周的1隻豚鼠共8耳的神經纖維顯著減少；與毛細胞損傷類似，耳蝸第一、二回神經纖維損壞較第三、四回嚴重（圖3）。

3 討 論

氨基糖甙類抗生素耳中毒與氧自由基毒性作用密切相關〔4〕，袢利尿劑可致血管紋中毒，使分泌內淋巴液功能受損〔2〕。上述兩類葯物聯合應用時，氨基糖甙類抗生素與內耳毛細胞膜接觸,增加了內耳毛細胞的通透性，而袢利尿劑以較高的濃度進入到細胞內，引起毛細胞的損傷〔5〕。

1979年Russell等〔6〕最早將KM和利尿酸兩種葯物聯合應用於豚鼠。Asakuma等〔7〕研究速尿和利尿酸對使用和未用硫酸卡那黴素豚鼠的耳蝸內直流電位的影響。

Bobbin等〔8〕用高效液相色譜法（HPLC）研究豚鼠耳蝸鉀誘導γ-氨基丁酸（GABA）和其他物質的釋放。對豚鼠耳蝸進行正常K+ 濃度（5 mmol/L）和高K+（50 mmol/L）的人工外淋巴液灌流，包括正常動物和事先用卡那黴素和利尿酸破壞Corti氏器組，發現暴露於高鉀耳蝸灌流液中者其?酌-氨基丁酸（GABA）、2-氨基乙磺酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸等明顯高於正常鉀濃度組；與正常組比較，Corti氏器破壞組鉀誘導的GABA、2-氨基乙磺酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸等釋放明顯減少。從結果分析，認為 GABA釋放與其是耳蝸的神經遞質符合。

Raphael等〔9〕 用組織化學和電鏡技術研究使用耳毒性葯物後的豚鼠耳蝸結構和分子變化，發現耳蝸毛細胞表皮板和靜纖毛上的肌動蛋白絲消失，在將要死亡的毛細胞頂端區域出現富含肌動蛋白的橋樣結構，兩個支持細胞在原毛細胞所在部位形成瘢痕，支持細胞擴張並侵入Nuel間隙和先前毛細胞所在的區域，瘢痕區域可被細胞角蛋白標記。研究還發現最後發生變性的部位是毛細胞頂端，毛細胞變性與瘢痕形成同時發生。在本研究中，我們用掃描電鏡觀察，也發現在嚴重損傷的豚鼠耳蝸，感覺上皮區域全部被瘢痕取代（圖1）。

從我們先前的試驗結果可以看出，KM和速尿兩種葯物聯合應用於豚鼠，所造成的耳聾為雙側對稱性，用葯1周即導致試驗豚鼠半數出現重度感音神經性聾〔3〕。對這些致聾豚鼠的耳蝸病理研究發現：耳蝸毛細胞嚴重受損，以外毛細胞損傷為主，第一、二回耳蝸毛細胞損傷比第三、四回嚴重；對耳蝸神經纖維染色發現致聾豚鼠的神經纖維顯著減少，同樣表現為第一、二回減少比第三、四回嚴重。探討KM和速尿所致毛細胞損傷的上述表現的機制，可能是外毛細胞吞噬耳毒性葯物的能力要比內毛細胞強，而且底回外毛細胞和頂回外毛細胞攝取耳毒性葯物的能力也有所不同。至於為什麼不同部位的毛細胞具有不同的葯物攝取能力，推測可能與細胞膜上的葯物輸送結構（drug transporter）的分布和活動性有關〔4〕。

董民聲等的實驗證明〔2〕，連續肌肉注射KM 6天後內耳的感覺細胞首先受損，支持細胞的變性明顯比毛細胞的變性晚，螺旋神經節及神經纖維的變性更遲，故認為內耳感覺細胞的損傷是KM造成聽力損害的根本原因。我們的實驗結果在內耳感覺細胞的損傷方面與之相吻合，但是我們發現KM和速尿兩種葯物聯合應用後，不僅內耳感覺上皮受到損害，聽神經纖維也受到損害。

2004年，Nourski等〔1〕報道用KM和利尿酸建立急性耳聾動物模型，觀察了這種方法在急性豚鼠實驗過程中的有效率，檢測聽覺敏感度和聽神經狀態。為此目的而重復檢測聲誘發復合動作電位（ACAP）和電誘發復合動作電位（ECAP），發現6隻豚鼠中有4隻ACAP幅值在利尿酸給葯的4 ~ 6小時內降至0，然而剩下的2隻動物在給葯10小時內ACAP持續存在反應。在同一時間作者還記錄了ECAP，與ACAP不同，ECAP幅值在每個試驗中都相對恆定，而且證明沒有出現與給葯後的時間或者ACAP的作用相巧合的變化。綜合ACAP和ECAP的結果，作者得出的結論是KM和利尿酸葯物效應為靶向損害毛細胞功能而沒有明顯抑制聽神經反應性，這與我們的實驗似乎有部分結果相矛盾。產生這一差別的原因應為用葯後觀察的時間點不同：Nourski等的觀測時間是用葯後10小時內，而我們的觀察是在用葯1周以後，可能是在用葯後10小時內聽覺神經纖維還沒有受到損傷，而1周時開始出現神經纖維損傷，用葯3周後神經纖維損傷明顯。

【參考文獻】
1 Nourski KV, Miller CA, Hu N, et al. Co- administration of kanamycin and ethacrynic acid as a deafening method for acute animal experiments. Hear Res, 2004, 187(1-2): 131-133.

2 董民聲， 董明敏，婁衛華. 內耳疾病研究進展. 鄭州: 河南醫科大學出版社， 1999: 12 -22

3 張賢芬， 楊仕明， 胡吟燕，等. 卡那黴素和速尿聯合用葯後豚鼠耳蝸聽功能研究. 中國聽力語言康復科學雜志， 2008， 6(2): 15-20.

4 丁大連， Salvi R. 氨基糖苷類抗生素耳毒性研究. 中華耳科學雜志， 2007， 5 （2）： 125-131.

5 張亞梅. 葯物中毒性耳聾. 中華兒科雜志， 2000， 38（12）: 781-782.

6 Russell NJ, Fox KE, Brummett RE. Ototoxic effects of the interaction between kanamycin and ethacrynic acid. Cochlear ultrastructure correlated with cochlear potentials and kanamycin levels. Acta Otolaryngol，1979, 88 (5-6): 369-381.

7 Asakuma S, Snow JB. Effects of furosemide and ethacrynic acid on the endocochlear direct current potential in normal and kanamycin sulfate-treated guinea pigs. Otolaryngol Head Neck Surg, 1980, 88(2): 188-193.

8 Bobbin RP, Ceasar G, Fallon M. Potassium inced release of GABA and other substances from the guinea pig cochlea. Hear Res, 1990, 46(1-2): 83-93.

9 Raphael Y, Altschuler RA. Scar formation after drug- inced cochlear insult. Hear Res, 1991, 51(2): 173-183.

Ⅱ 轉基因植株的花葯在卡納黴素培養基上做離體培養，則獲得的再生植株群體中抗卡納黴素的植株佔多少

佔100%啊。

因為在卡納黴素培養基上做離體培養，培養出的植株都是抗卡那黴素的，那麼再生植株當然全部抗卡納黴素了。

Ⅲ 三角燒瓶中加了卡那黴素的LB培養基被紫外照了2個小時，卡那黴素會失效嗎，紫外能透過三角燒瓶的玻璃作用嗎

不會失效，紫外線穿透能力極弱，根本不可能穿透玻璃。即使你把培養基完全暴露在紫外線之下，紫外線也只能穿透薄薄的一層，不會對培養基造成明顯影響。

Ⅳ 在培育轉基因植物的研究中，卡那黴素抗性基因（kan）常作為標記基因，只有含卡那黴素抗性基因的細胞才能

（1）圖中A為基因表達載體的構建過程，該過程需要限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和運載體，還需DNA連接酶將目的基因和運載體連接形成重組質粒．
（2）基因表達載體的組成包括：目的基因、啟動子、終止子和標記基因．
（3）質粒的化學本質是小型環狀DNA．B過程是培養並選擇含有重組質粒的土壤農桿菌，其中「選擇」體現了質粒作為運載體必須具備具有標記基因；「培養」體現了質粒作為運載體必須能在宿主細胞中復制並穩定保存．
（4）C過程為誘導選擇，既要誘導出愈傷組織還要進行篩選，篩選出被含重組質粒的農桿菌侵染的葉片細胞，淘汰掉普通細胞，故應添加卡那黴素．
（5）如果要檢測轉基因是否成功，D過程最好採用放射性同位素標記的抗蟲基因作為探針，利用DNA分子雜交原理進行檢測．
（6）抗蟲基因能在棉花細胞內表達，其根本原因是所有生物共用一套遺傳密碼．
故答案為：
（1）限制酶和DNA連接酶．
（2）終止子、目的基因、標記基因
（3）小型環狀DNA 在宿主細胞內自我復制、含有標記基因．
（4）卡那黴素
（5）放射性同位素（或熒光分子）標記的抗蟲基因
（6）所有生物共用一套遺傳密碼

Ⅳ 培育轉基因植物，生物

5、A過程需要的酶有_限制性內切酶、DNA連接酶_。
解析：A過程是基因表達載體的構建，用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個缺口，露出黏性末端。然後用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。將切下的目的基因的片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，質粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就會因鹼基互補配對而結合，形成一個重組DNA分子。

6、B過程及其結果體現了質粒作為運載體必須具備的兩個條件是：1.能夠在宿主細胞中復制 2.穩定的保存
解析：作為重組基因的載體，必須能夠在宿主細胞中復制，使重組基因能夠在宿主基因中復制，從而穩定保存下來，這是作為運載體的必須條件。
另外兩個條件，但不是必須的：1.具有多個限制酶切點：從而可以使不同的粘性末端與之相連，增強實用性2.具有某些標記基因:擁有標記基因是為了方便質粒進入宿主細胞後容易被檢測出來，以便檢測目的基因是否導入受體

7、C過程的培養基除含有必要營養物質、瓊脂和激素外，還必須加入_卡那黴素_
解析：加入卡那黴素用於篩選重組載體，將非重組載體的個體淘汰掉

8、如果利用DNA分子雜交原理對再生植株進行檢測，D過程應該用_DNA作_作為探針。
解析：DNA分子雜交 ：DNA分子雜交的基礎是，具有互補鹼基序列的DNA分子，可以通過鹼基對之間形成氫鍵等，形成穩定的雙鏈區。

9、科學家發現轉基因植株的卡那黴素抗性基因的傳遞符合孟德爾遺傳規律。

①將轉基因植株與_卡那黴素敏感型植株_雜交，其後代中抗卡那黴素型與卡那黴素敏感型的數量比為1：1。
解析：後代中抗卡那黴素型與卡那黴素敏感型的數量比為1：1。說明此雜交方式為測交，抗卡那黴素型為顯性雜合體（Aa），卡那黴素敏感型為隱性純和（aa），雜交後代表現型抗卡那黴素型與卡那黴素敏感型的數量比為1：1。

②若該轉基因植株自交，則其後代中抗卡那黴素型與卡那黴素敏感型的數量比為_3：1_。
解析：抗卡那黴素型為顯性雜合體（Aa）雜交，即Aa*Aa，後代性狀分離比是抗卡那黴素型：卡那黴素敏感型=3：1，基因型分離比是AA:Aa:aa=1:2:1

③若將該轉基因植株的花葯在卡那黴素培養基上作離體培養，則獲得的再生植株群體中抗卡那黴素型植株占_100_%。
解析：如果培養基不加卡那黴素，那麼其再生植株中有一半是卡那黴素敏感型，另一半是抗卡那黴素型，但此題中說明在卡那黴素培養基上作離體培養，也就是說加入了卡那黴素，對再生植株群體起到一個選擇作用，將卡那黴素敏感型全部淘汰掉，只留下抗卡那黴素型，因此培養基中全部是抗卡那黴素型，占總數的100%

Ⅵ 一個質粒攜帶有氨苄青黴素抗性基因和卡那黴素抗性基因

按照你的表述，EcoRI酶切位點是在卡那黴素抗性基因內部？

那麼，如果這個抗性基因插入了你的目的基因，那麼這個基因就被破壞，也就失去了卡那抗性。

所以，插入了目的基因的質粒，應該是只有氨苄抗性的。所以轉化之後塗平板，不能用雙抗，只能用氨苄抗性。

要鑒別是否插入目的基因，很簡單：

1，菌落pcr：從轉化平板上隨機挑選幾個菌落，用普通pcr體系，以菌體為模板，做pcr，然後跑膠鑒定。(我的經驗，這一步陽性了就基本准了)

2，從菌落pcr陽性菌內提質粒酶切鑒定。（這個最准）

3，如果你實在是要求用抗性來篩（其實抗性篩選不是很准），你用兩種平板，一種是amp平板（也就是轉化用的平板），一種是amp+kan平板，你用接種環或者滅過菌的牙簽，從amp轉化平板上的菌落點一下，再在amp
+kan平板上原位點一下，培養。
如果同一個菌落，只能在amp上長，而不能在雙抗上長，就可能是重組質粒。

Ⅶ 硫酸卡那黴素的葯物分析

方法名稱： 硫酸卡那黴素—卡那黴素的測定—高效液相色譜法
應用范圍： 本方法採用高效液相色譜法測定硫酸卡那黴素中卡那黴素(C18H36N4O11)的含量。
本方法適用於硫酸卡那黴素中卡那黴素的含量測定。
方法原理： 取卡那黴素對照品適量，精密稱定，加水溶解並製成不同濃度的溶液，精密量取注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品溶液濃度的對數值與相應的峰面積對數值計算回歸方程，另取本品適量，加水溶解，同法測定，用回歸方程計算供試品中C18H36N4O11含量，即得。
試劑： 1. 甲醇
2. 三氟醋酸
儀器設備： 1. 儀器
1.1 高效液相色譜儀
1.2 色譜柱
十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。
1.3 蒸發光散射檢測器
2. 色譜條件
2.1 流動相：0. 2mol/L三氟醋酸溶液+甲醇=95 5
2.2 漂移管溫度：110℃
2.3 柱溫：室溫
2.4 載氣流量：3.0L/min
試樣制備： 1. 對照品溶液的制備
精密稱取卡那黴素對照品適量，加水溶解並製成每1mL中約含卡那黴素0.10、0.15、0.20mg的溶液，搖勻，即為對照品溶液。
2. 供試品溶液的制備
取本品適量，精密稱定，加水溶解並定量稀釋成每1mL中約含0.15mg的溶液，搖勻，即為供試品溶液。
註：「精密稱取」系指稱取重量應准確至所取重量的千分之一。「精密量取」系指量取體積的准確度應符合國家標准中對該體積移液管的精度要求。
操作步驟： 精密量取不同濃度對照品溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度的對數值與相應的峰面積對數值計算回歸方程，相關系數（r）應不小於0.99。另取供試品溶液，同法測定，用回歸方程計算供試品中C18H36N4O11的含量。
參考文獻： 中華人民共和國葯典，國家葯典委員會編，化學工業出版社，2005年版，二部，p.724-725。

Ⅷ 戴爾沃慢抗檢測方法

Delvotest法最
早在香港傳到廣東的，其使用是基於20世紀80年代初香港要求廣東出口的生奶必須「無抗」且要求採用Delvotest法檢測。該方法也是生物測定法，其試劑是由荷蘭DSM公司生產並由AOAC認證。原理是利用微生物—嗜熱芽胞菌在64℃條件下培養2.5～3小時後會產酸,酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變為黃色;若牛奶樣品中不含抗生素,培養後樣品呈黃色,如樣品中含有抗生素, 嗜熱芽胞菌生長受到抑制而無法產酸,指示劑將不變色.
Delvotest法的操作步驟:
1.以無菌操作將一片營養葯片夾放入小試管內;
2.用微量移液管將0.1mL牛奶樣品注入小試管內;
3.把小試管放入已預熱至64℃的水浴箱或恆溫器中培養;
4).定時3小時取出觀察顏色變化.如果底部2/3的固體介質是黃色,則為陰性, 如果底部2/3的固體介質是紫色,則為陽性.)
Delvotest法具有廣譜性,可檢測到?-內醯胺類抗生素在內的更多抗生素,如磺胺類、四環素類、大環內酯類、氨基糖苷類、氯黴素等，其中對青黴素和磺胺類抗生素特別靈敏. 其靈敏度為：青黴素:3ppb,鏈黴素:300ppb,慶大黴素:400ppb,卡那黴素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便，嚴格實用，容易判斷，結果可靠，費用適中等優點；但也易出現假陽性，實驗證明：當牛奶樣品中添加微生物防腐劑(如乳酸鏈球菌素—Nisn)或樣品中有足夠的洗滌劑殘留時，便可影響嗜熱芽胞菌生長而使實驗為陽性。

Ⅸ 請教檢測食物含抗生素的簡單方法（我是老師想做這方面實驗）

牛奶中抗生素殘留的幾種常用檢測方法
隨著奶牛飼養業的發展，抗生素在預防和治療奶牛疾病方面得到廣泛的應用。生鮮牛奶中抗生素的來源主要是：第一，治療泌乳期病牛時使用的抗生素會從奶牛體內移行到乳腺殘留進入牛奶中，資料表明治療後的奶牛，其擠出的牛奶5天內都有抗生素殘留；其二，為了預防奶牛疾病並提高產量，在奶牛飼料中添加抗生素也會造成牛奶中抗生素的殘留；第三，由於牧場管理不善，擠奶、儲奶沒有嚴格的衛生制度和配套的設施，人為添加或造成牛奶抗生素的污染。
牛奶中含有抗生素，不僅對人的健康造成很大的危害，而且對乳品加工企業帶來經濟損失（因無法生成酸奶和乳酪）。因此必須嚴格控制牛奶中抗生素殘留，除了要做好科學飼養、精心管理；正確擠奶和預防疾病外，還要規范抗生素的使用，按國標中有關規定，用葯後的奶牛5天後所產的牛奶才可作為原料乳，並且要檢測其殘留。世界糧農組織（FAO）、世界衛生組織（WHO）、歐盟（EC）及美國的食品和葯品管理局（FDA）等對食品中抗生素最大殘留量都有明確的規定，我國也有鮮奶中抗生素殘留量檢驗標准（GB4689.27—94）。
目前，鮮奶中抗生素殘留的檢測方法大致分為三類：生物測定法（微生物測定法、放射受體測定法）、免疫法（放射免疫法、熒光免疫法、酶聯免疫法）、理化分析法（波譜法、色譜及聯用技術）。下面介紹幾種常用的牛奶中抗生素殘留檢測方法。
TTC法
TTC法是我國鮮奶中抗生素殘留量檢驗標准（GB4689.27—94）的檢測法，屬生物檢測法。其測定原理基於抗生素對微生物的抑製作用。如果牛奶中含有抗生素，則加入菌種（嗜熱鏈球菌）經培育2.5~3小時後,加入TTC指示劑(三苯基四氮唑)不發生還原反應,所以樣品呈無色狀態;如果牛奶中不含抗生素,則樣品呈紅色.這樣實驗後樣品顏色不變的為陽性,樣品染成紅色的為陰性。
TTC法的具體操作步驟:
1.菌液制備:將單菌種(嗜熱鏈球菌)以脫脂乳為培養基,在36±1℃培養箱中培養15小時後,再以脫脂乳以至於1:1稀釋待用;
2.取待檢樣液9mL,在80℃水浴加熱5分鍾後冷卻到37℃以下,加活菌液1mL,在36℃±1℃水浴2小時,加入4%的TTC指示劑0.3mL, 36℃±1℃水浴培養30分鍾;
3.若樣液顏色不變為陽性,呈紅色為陰性;若陽性的樣液,再置於水浴中培養30分鍾,不顯色的為陽性,呈紅色為陰性.
TTC法測定各種抗生素的靈敏度為:青黴素:4ppb,鏈黴素:500ppb,慶大黴素:400ppb,卡那黴素:5000ppb.它具有費用低,易開展的優點;缺點是耗時長，要求操作人員需有一定專業知識且實驗過程中菌液的制備、水浴過程式控制制都要求嚴格遵守操作規程，否則易出現假陽性，以致出現檢驗結果的不穩定性。
Delvotest? sp法（戴爾沃檢測法）
該法最早在香港傳到廣東的，其使用是基於20世紀80年代初香港要求廣東出口的生奶必須「無抗」且要求採用Delvotest法檢測。該方法也是生物測定法，其試劑是由荷蘭DSM公司生產並由AOAC認證。原理是利用微生物—嗜熱芽胞菌在64℃條件下培養2.5～3小時後會產酸,酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變為黃色;若牛奶樣品中不含抗生素,培養後樣品呈黃色,如樣品中含有抗生素, 嗜熱芽胞菌生長受到抑制而無法產酸,指示劑將不變色.
Delvotest? sp 法的操作步驟:
1.以無菌操作將一片營養葯片夾放入小試管內;
2.用微量移液管將0.1mL牛奶樣品注入小試管內;
3.把小試管放入已預熱至64℃的水浴箱或恆溫器中培養;
4).定時3小時取出觀察顏色變化.如果底部2/3的固體介質是黃色,則為陰性, 如果底部2/3的固體介質是紫色,則為陽性.
Delvotest? sp 法具有廣譜性,可檢測到?-內醯胺類抗生素在內的更多抗生素,如磺胺類、四環素類、大環內酯類、氨基糖苷類、氯黴素等，其中對青黴素和磺胺類抗生素特別靈敏. 其靈敏度為：青黴素:3ppb,鏈黴素:300ppb,慶大黴素:400ppb,卡那黴素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便，嚴格實用，容易判斷，結果可靠，費用適中等優點；但也易出現假陽性，實驗證明：當牛奶樣品中添加微生物防腐劑（如乳酸鏈球菌素—Nisn）或樣品中有足夠的洗滌劑殘留時，便可影響嗜熱芽胞菌生長而使實驗為陽性。
Snap?法
該方法是酶聯免疫法，由美國IDEXX公司生產其檢測分析儀及其試劑盒，均獲得AOAC認證，它利用了竟爭酶聯免疫技術。其基本原理是用特異性抗體將固相載體激活，加入含待測抗原的溶液和一定量的酶標記抗原在45℃±5℃共同保溫，使樣品內的抗生素與內置抗生素標志物竟爭與固定的抗體結合，然後進行洗滌和顯色，內置抗生素標志物與固定的抗體結合形成的復合體，通過酶的作用分解可形成有色物質，通過測定色度並與參照物對照，就可以確定結果是陽性或陰性。
Snap?法操作步驟：
1.加入乳樣於樣品管中,搖勻,加熱樣品和檢測板5分鍾;
2.加入乳樣於樣品孔中,當激活圓環開始退卻時,按Snap鍵;
3.反應4分鍾,由Snap?讀數儀讀取並列印結果.檢測讀數小於1.05時判為陰性,大於1.05時判為陽性.
Snap?法是一種將酶化學反應的敏感性和抗原抗體免疫反應的特異性相結合的方法,其敏感性和特異性好,檢測的靈敏度以普遍使用的?-內醯胺類計：青黴素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨苄西林:10ppb,頭孢西林:8ppb.其他抗生素如四環素等的檢測,則需購買相應的試劑來檢測. Snap?法檢測結果快速准確, 9分鍾內即可檢測出牛奶中?-內醯胺類、四環素類、磺胺類等抗生素的殘留含量，且有半定量的讀數，可監控牧場用葯的情況；檢測儀器穩定性良好，結果重現性高，整個檢測過程簡單方便；但需購置專用儀器和試劑，成本較高。
高效液相色譜檢測法
它是一種理化檢測方法,是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應來測定其含量.檢測的過程採用了氣相色譜理論,通過高壓液相和高靈敏度的檢測器,分離速度快、效率高和操作自動化。一般要經過樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟，能檢測抗生素的具體含量，敏感性較高，但檢測程序復雜，費用較高，需購買色譜儀等檢測設備，不適合小型檢驗室。
傳統的抗生素檢測方法不少,有的操作煩瑣,有的實驗條件要求高,有的檢驗時間太長;這些不僅會給乳製品生產企業造成經濟上和時間上的損失,而且檢測結果常常會被原輔材料和人為操作等因素所影響.鑒於牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛生問題,乳品企業及牧場應重視和加強檢測工作,應用一些簡單、快速和准確性高的方法來監控產品的質量，保證消費者的健康。
http://szddi.com/foodonline/newsdetail.asp?id=15933

反應原理
本產品主要是利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的基本原理來進行的。在整個反應當中,樣品中氯黴素含量越多，反應呈色就越淡。反之，樣品中氯黴素含量越少，則呈色越深。
試劑盒組成
1、微量測試孔：每條8孔，每板12條
2、氯黴素標准溶液：
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35 ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶
3、10倍濃縮萃取稀釋液：一瓶，30ml/瓶
4、10倍濃縮洗滌液：一瓶，30 ml /瓶
5、氯黴素酶標記物： 一瓶，8 ml/瓶
6、底物溶液：一瓶，12 ml/瓶
7、反應終止液：一瓶，13 ml/瓶
使用說明
A、注意事項
1、使用前先將氯黴素標准溶液6瓶，濃縮萃取稀釋液，濃縮洗滌液，酶標記物，底物溶液及微量測試孔條置於室溫下，回溫30分鍾。
2、原倍萃取稀釋液及洗滌液配製
用蒸餾水將10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別以1： 9的比例稀釋(即1mL濃縮液+9mL蒸餾水)，即可作為樣品萃取稀釋液與微孔板清洗液。
3、回溫後，取出所需微量測試孔條，將剩餘板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置於4oC保存。
B、樣品制備
1.待測物為生乳，則依以下方法進行處理 (5倍稀釋)
取100ul待測生乳加入400ul萃取稀釋液，振盪混合後備用。
2.待測物為蜂蜜，則依以下方法進行處理
a.取2g蜂蜜、4ml蒸餾水與2ml 乙酸乙酯置入離心管中，震盪約5分鍾，使其充分混合均勻。
b.離心10分鍾(3000rpm)，取0.5ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，於50℃下氮氣吹乾(溫度請勿超過50oC)。
c.加入0.5ml萃取稀釋液，震盪約10秒鍾後備用。
3. 待測物為血清、則依以下方法進行處理
a.抽取待檢動物血液，離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用，注意不要有溶血。
b.將3ml血清加入離心管中，再加入6ml乙酸乙酯，震盪混合約30秒。
c.離心10分鍾(3000rpm)，取2ml上層液(乙酸乙酯)至玻璃管中，於50oC下氮氣吹乾。
d.於此玻璃管中加入正己烷2ml，先將殘余物完全溶解後，再加入1 ml萃取稀釋液，震盪約30秒鍾。
e. 離心10分鍾(3000 rpm)，用吸管吸去上層液(正己烷) 及中間乳化層部分，棄掉。再吸取下層液(水層)備用。
f.若有乳化現象，請先將大部分上層液(正己烷)取出後，再將玻璃管置入80oC水中，隔水加熱約5~10分鍾，可改善乳化情形。
4. 待測物為雞肉或魚、蝦，則依以下方法進行處理
a.將3克樣品剪碎後放入50 ml離心管中，再加入6ml乙酸乙酯，並以均質機均質約1分鍾，再震盪約30秒。
b.離心10分鍾(3000rpm)，取2ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，於50oC下氮氣吹乾。
c.於此玻璃管中加入正己烷2 ml，先將殘余物完全溶解後(若未能完全溶解，可能會導致回收率降低)，再加入1 ml萃取稀釋液，震盪約30秒鍾。
d.離心10分鍾(3000 rpm)，用吸管吸去上層液(正己烷) 及中間乳化層部分，棄掉。再吸取下層液(水層)備用。
e.若有乳化現象，請先將大部分上層液(正己烷)取出後，再將玻璃管置入80oC水中，隔水加熱約5~10分鍾，可改善乳化情形。待測物為血清、則依以下方法進行處理
5.待測物為內臟(肝、心等)，則依以下方法進行處理(5倍稀釋)
同上述步驟a~d，但下層液吸出後，再以萃取稀釋液稀釋5倍(即下層液50ul加萃取稀釋液200ml)。
6.待測物為飼料，則依以下方法進行處理(10倍稀釋)
同上述步驟a~d，但下層液吸出後，再以萃取稀釋液稀釋10倍(即下層液30ul加萃取稀釋液270ml)。
C、操作步驟
本產品的酶標記物與氯黴素標准溶液均直接使用，無需再稀釋。
1、於適當微孔中分別加入100mL標准溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。
2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前處理的樣品溶液。
3、再於每一微孔中另再加入50mL酶標記物。
4、輕敲盤子四周，使其充分混合後於室溫下避光靜置溫育1小時。
5、將微孔中的反應液甩掉，再將洗液加滿每一微孔後甩掉，重復洗3次。
6、最後一次甩掉後，在吸水紙上拍干。
7、於每一微孔中加入底物溶液100mL後，輕敲盤子四周，使其充分混合。
8、於室溫下避光靜置溫育20分鍾。
9、於每一微孔中加入100mL反應終止液。
10、用酶標儀於波長450nm下判讀。
D、判定
1. 計算B/B0值。用樣品或標准液吸光度值(B)除以零標准吸光度值(B0)再乘以100%。
2. 以B/B0值為縱坐標，以標樣濃度的對數值為橫坐標，做標准半對數曲線。
3. 根據每個樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。
4. 由於樣品經過了預先稀釋，因此根據標准曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。
E、標准曲線

F、靈敏度
氯黴素試劑檢測盒的平均檢測下限為 0.05ppb，此濃度之吸光值與陰性標准溶液(0ppb)之吸光值有明顯的差異。
G、 特異性
針對以下抗生素進行交叉反應之測試，結果如下：
Chloramphenicol =100%
Chloramphenicol(free base) <0.1%
Gentamycin <0.1%
Tetracycline <0.1%
Penicillin G <0.1%
Sulfamethazine <0.1%
H、再現性
針對氯黴素檢測試劑盒精密度測試，重復6次，所得不同濃度標准溶液的吸光值變異系數(%CV)如圖2所示，顯示氯黴素試劑盒有很高的再現性:

I、回收率
生乳(添加1.0ppb)104~117%
蜂蜜(添加0.3ppb)90~110%
蝦及魚肉(添加0.5ppb)95~110%
雞肉(添加0.5ppb) 90~120%
血清(添加0.5ppb)100~120%
內臟(添加1.0ppb) 100~120%
飼料(添加2.0ppb)80~110%

氯黴素檢測試劑盒
簡介
氯黴素(Chloramphenicol)是一種廣譜抗生素。由於其具有效果好以及價格低廉等優點，目前已被普遍應用於各類家禽、家畜、水產品及蜂製品的各種傳染性疾病的治療。然而氯黴素有其嚴重的副作用,它會抑制人體骨髓的造血功能，從而引起再生障礙性貧血和粒細胞缺乏症。目前，我國已禁止其使用。
我公司採用國內外先進的工藝與技術，研發出氯黴素ELISA檢測試劑盒，簡化了樣品處理方式，使用簡便，省時省力省錢，整個操作過程不到90分鍾。本產品檢測范圍廣(雞肉、魚、蝦、蟹、牛奶、血清、肌肉、組織、飼料與蜂蜜等)，回收率為80%－120%，靈敏度可達到0.05ppb，是各類企業及各級政府檢測機構的理想產品。
簡單
1． 樣品提取方便快捷。
2． 90分鍾得到結果。
3． 只需基本的實驗室設備。
4． 操作人員只需最基本的實驗知識。
准確
1． 結果重現性高。
2． 精確至0.05ppb。
3． 與其它抗體的交叉反應率極低。
技術支持
我們為用戶提供最方便、快捷、周到的服務。
產品規格
包裝：每包96孔
靈敏度: 0.05ppb
測試區間：0.05ppb－4.05ppb
檢測時間：80分鍾(提取後)
儲存條件：2-8℃

http://www.practical-bio.com.cn/htm/procts_05.htm