外源性基因连接方法

❶ 外源性dna离开染色体是不能复制的，将什么与什么连接

是这样的：有丝分裂前期，复制是指DNA和蛋白质的复制，复制后每一条染色体实际上包括两条并列的姐妹染色单体，这两条并列的姐妹染色单体之间不是完全分离开的，而是由一个共同的着丝点连接着，只要着丝点没有分离，这两个姐妹染色单体仍然是一个染色体。

线性DNA末端端粒部分并不是严格按照沃森和克里克的配对规则,形成了复杂的发卡结构.
端粒酶是一种核糖核蛋白复合物,具有逆转录酶的性质,以物种专一的内在RNA为模板,把合成的DNA添加到染色体的3’ 端
因此,端粒复制时,没有什么前导链和后随链.

❷ 常用的目的基因与载体的连接方法有哪些

目前已知有三种方法可以用来在体外连接DNA片段：
第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；（人教版高中生物选修3中提到的E·coliDNA连接酶，来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。）
第二种方法是，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；
第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。
粘性末端DNA片段的连接
DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。
平末端DNA片段的连接
常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。

❸ 要将外源基因转入到生物体中包括哪些主要步骤

1、获取目的基因 2、形成重组DNA分子 3、将重组DNA分子导入受体细胞 4、筛选含有目的基因的受体细胞 5、目的基因表达

• 工具：限制性核酸内切酶（切割磷酸二酯键）、DNA连接酶（链接磷酸二酯键）、载体（主 要为质粒、原核小型环状DNA）

• 获取目的基因：若序列已知则用PCR扩增或化学方法合成：若序列未知则建立基因文库，从中获取

• 形成重组DNA分子：用同一限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因形成相同的粘性末端，再用目的基因链接

• 将重组DNA分子导入受体细胞：若受体为动物用显微注射法：若受体为植物用农杆菌转化法或花粉管法：若受体为微生物用氯化钙处理法（增加细胞壁通透性）

• 筛选含有目的基因的受体细胞：利用载体上的标记基因进行筛选

• 目的基因表达：个体水平上的性状，分子水平上的相应蛋白质、mRNA

❹ 简述 如何将外源DNA连接到载体上

先用限制性核酸内切酶分别处理载体及目的基因，再用DNA连接酶连接。然后用载体上的标记基因筛选重组DNA，然后导入受体细胞，转基因完成

❺ 外源DNA和质粒载体的连接反应原理与步骤在哪些生物论坛可以了解求大神帮助

在生物帮那里就可以找到详细的介绍，楼主有空的话可以自己去详细的了解一下。那里提供最新、领先、精准、高效、全面的生物产品和技术信息。 外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。 DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子(分子内连接)还是位于不同分子(分子间连接)，都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA。在瓜作用的底物。如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大(因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率)。这倦，在DNA浓度低时，质粒DNA重新环化将卓有成效。如果连接反应中DNA浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊)从理论上探讨了DNA浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是DNA分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的DNA呈随机卷曲。这样，j与DNA分子的长度成反比(因为DNA越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用)，因此j对给定长度的DNA分子来说是一个常数，与DNA深度无关。j=[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA长度，以cm计，b是随机卷曲的DNA区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响DNA的刚度。 可以参考： That can help you.Click www.bio1000.com/zt/protein/225128.html, Sign in account. i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里No是阿佛伽德罗常数，M是DNA的摩尔浓度(单位：mol/L)。理论上，当j=i时，给定DNA分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化;当i>j，则有利于产生多联体。图1.9显示了DNA区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需DNA浓度之间关系(Dugaiczyk等，1985)。 现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源DNA片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源DNA末端的相对浓度的影响。当i是j的2-3倍(即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时)外源DNA末端浓度的2倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40%都是由单体质粒与外源DNA所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定(j:i=3)而带匹配末端的外源DNA的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。 涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含： 1)足量的载体DNA，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60μg/ml。 2)未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA，如外源DNA浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

❻ 请教，外源基因是怎样整合到基因组上

T-DNA是Ti质粒上的一个片断。利用农杆菌等微生物可将人工合成的目的基因片段通过T-DNA载体转移到受体植物的基因组中，是基因工程的重要技术手段。（度娘复制，个人认为没错。最佳答案别误导）

❼ 将外源基因导入原核细胞或真核细胞分别有哪些方法

1 物理方法
1.1 DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但注入量有限, 能够接触到的肿瘤细胞有限,故获得的肿瘤细胞转化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。
1.2 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从而提高肿瘤细胞的转化率。
2 化学方法
即用化学方法构建非病毒载体系统，借之完成基因转导。主要包括以下两种。
2.1 脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一种有价值的体内基因转移方法。多用于体外转化细胞，或通过瘤组织内注射〔1〕进行体内转化,并已有少数临床应用的报告。目前常用的是阳离子脂质体(商品名为Lipofectin)。它可自发的与DNA形成复合物，保护外源DNA不被核酸酶降解，具有制备简单、安全无毒、无免疫原性、重复性、对基因片段大小无限制且转染操作方便等优点。由于它可与细胞膜直接融合而能有效地避免溶酶体破坏，故远比传统的脂质体效率高。缺点是靶向性有限。Nishikawa等〔2〕从BALB/c小鼠的尾静脉注射以荧光素酶基因为报告基因的质粒DNA-脂质体复合物， 发现肺、肝、脾等器官组织中都有荧光素酶基因及其产物，持续表达超过3个月。常规脂质体易被网状内皮系统(RES)细胞摄取，在巨噬细胞本身可成为靶细胞的部位，RES的这种亲合性是有利的。Hasegawa等〔3〕采用日本血凝病毒( hemagglutinating virus of Japan , HVJ)脂质体为载体，用HSV-tk/Gcv系统治疗肝癌发现，在体外试验中当Gcv的浓度100microg/ml时几乎所有肿瘤均被杀死，甚至当转导率只有20％时，也有1/3肿瘤被消灭。此方法重复应用效果更佳，且皮下注射未见明显的炎症反应。
2.2 受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。此法靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂，表达效率低下。利用氯哇抑制溶酶体酶或腺病毒与内吞小泡相融合而将其破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。
3 生物学方法
主要通过构建病毒载体来完成。
3.1 逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基因容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低，且其随机整合有引起“插入性突变”的可能〔4〕。
3.2 腺病毒(adenovirus, Adv): 为近年肝细胞肝癌基因治疗中报告最多的一种病毒载体〔5〕。体外制备滴度较大 ，装载外源基因容量最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引起宿主免疫反应而使转染效率下降，且大剂量静脉给予可导致严重的肝脏炎症反应，因此通过全身给药受到限制。Nagao等〔6〕发现瘤内注射重组Adv后，目的基因可有效表达，但表达时间短暂，重复注射后表达效率降低且诱发体液和细胞免疫反应。
3.3 单纯疱疹病毒：单纯疱疹病毒(herps simplex virus，HSV)对非分裂细胞有天然的亲合力，装载外源基因容量达30kb，体外制备滴度接近腺病毒。但构建时难以除去与裂解细胞有关的基因而对细胞毒性大〔7〕。
3.4 腺相关病毒：腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)在人类不引起任何病理性后果，它能感染非分裂S相细胞，还能将基因转人非周期(noncyling)肿瘤细胞。AAV是一种缺陷前病毒，对人类无致病性。能用于运载外源性重组基因组，已应用于肝和肝癌细胞的治疗基因转移〔8〕。
3.5 其他病毒：痘苗病毒〔9〕(vaccini virus)可以独立在细胞之中复制和转录，并能以较强的方式表达多个肿瘤抗原。杆状病毒〔10〕(bacul virus)能够感染肝细胞和肝肿瘤细胞，并能增强肝细胞肿瘤坏死因子a(TNFa)、IL-1a、IL-lβ的表达。

❽ 外源基因是如何整合到受体细胞的DNA上的

用相同的限制性的内切酶，把外缘基因部分切出来，受体细胞的DNA上也打开同样的缺口，这是具有了相同的黏性末端，混合后，然后再用DNA连接酶连接，即可把外源基因是整合到受体细胞的DNA上

❾ 基因片段用什么拼接怎样拼接

粘性末端法,又称限制性内切酶酶切法。要求两种DNA分子具备同一个限制性内切酶切点,能产生互补的粘性末端。主要缺点是较难选择重组质粒,而且当外源DNA片段的长度超过载体DNA较多时,形成的重组质粒的转化率较低

❿ 分子克隆中常用的连接方法及原理

方法：DNA片段的制备、载体的选择、片段与载体连接。在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。

原理：外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。

但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。

载体DNA的选择

质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松弛型”。此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。

以上内容参考：网络-分子克隆