核酸分析方法视频

① 干货分享 | 快速了解什么是实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是一种高效的核酸检测和定量分析方法。以下是关于实时荧光定量PCR的详细解析：

1. 技术背景：

   • 自上世纪80年代PCR技术诞生以来，它一直在生命科学领域中发挥重要作用。
   • 传统PCR的定性和半定量特性限制了其应用范围，因此实时荧光定量PCR应运而生。

2. 核心原理：

   • 荧光标记技术：利用SYBR Green I染料或TaqMan探针实时监测PCR扩增过程中DNA的浓度变化。
     • SYBR Green I染料结合于DNA双链，随着DNA浓度的增加，荧光强度逐渐增强。
     • TaqMan探针则利用荧光淬灭与分离机制，确保检测的高特异性。
   • 关键术语：如CT值、惰性参比染料和溶解曲线，这些术语在数据解读中起到重要作用。

3. 实验步骤：

   • 准备试剂和耗材：包括模板、引物、qPCR mix等。
   • 配制反应体系：在冰上进行，确保引物浓度适当，反应体系体积选择恰当。
   • 上机实验：避免气泡，设置好样本信息和程序后进行实验。
   • 数据分析：导出数据，应用公式如△CT、△△CT和RQ来分析实验结果。

实时荧光定量PCR以其高效、准确和特异性的特点，成为现代核酸检测和定量分析的黄金标准。

② 核酸分析技术有哪些

总的来说包括了核酸的分离、提纯，核酸的扩增，检测，定性与定量分析等。下面以DNA为例说一下相关的概念。

1、DNA的分离提纯就那些试剂，那些步骤，网上一大堆视频的，自己去找吧。

2、扩增一般指的是PCR，需提供引物（引物具有特异性，比如说乙肝病毒基因的引物只能扩增乙肝病毒基因）、酶、底物等，三个流程一个循环：变性、复性、延长。

3、检测一般有紫外分光光度法，电泳分析，杂交分析。

（1）紫外分光光度法：此法的原理涉及到一些光学的知识，可以查询相关书籍以能更好的理解，可以做定量分析，分为单组份分析和多组分分析。

单组份分析有：

1）标准曲线法：用不通浓度的标准溶液，同一条件下测定吸光度A，以吸光度A为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据测得的待测样品吸光度，从标准曲线中便可知溶液浓度。

2）标准对照法：标准溶液浓度a，吸光度A，待测样品吸光度B，则根据朗-比定律有待测样品浓度为：B*a/A。

3）吸光系数法：吸光系数K，测得待测样品吸光度A，溶液的厚度d，根据朗-比定律，则待测样品的浓度为：A/(K*d)。

多组分分析没研究过了，自己查查相关资料吧。

（2）电泳分析是根据DNA的分子量和结构不同而在电场中的移动速度不同的原理，电泳的时候需要加MARKER或者已知的基因的片段进行测量。说说MARKER的概念吧，MARKER是由一些列一定梯度的基因片段组成的基因混合物，梯度一般有100bp，200bp，500bp等，MARKER电泳过后便形成很多条距离相等的条带，每两条条带之间的距离为前面提到的梯度值，MARKER用来做标准参考，具有标尺的作用

③ HIV核酸检测HIV核酸检测方法及程序

HIV核酸检测方法及程序

一、HIV核酸定性检测

1.1 方法和试剂

1.1.1 方法：HIV核酸定性检测采用商品化试剂盒或实验室自建方法，商品化试剂需严格遵循说明书操作。实验室自建方法如下：

(1) 使用逆转录PCR（RT-PCR）方法检测血浆或血清样品，建议第一轮PCR扩增使用RT-PCR一步法。血细胞或组织样品则使用PCR方法，一般采用扩增两轮的套式PCR方法。

(2) 设立阳性、阴性及空白对照，阳性对照含目的基因，阴性对照不含目的基因，与待测样品处理程序一致。阴性对照数量应根据实验样品数量设置，并分散放置。

1.1.2 试剂：PCR引物用于扩增HIV gag、pol、env、LTR等区域。进行RNA逆转录时可使用下游特异性引物或随机引物。引物设计可参考文献或自行设计，应广泛覆盖常见HIV流行毒株。抗污染试剂用于实验室自建检测方法。

1.2 扩增目的基因片段

1.2.1 样品采集和处理：收集样品并妥善处理，避免RNA降解。DNA保存于-20℃，RNA和需长期保存的DNA于-80℃。

1.2.2 核酸提取：使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离或自动化仪器提取，注意保护RNA不被降解。

1.2.3 逆转录合成cDNA：使用商品化试剂，按说明书操作，确保RNA酶抑制剂、dTta等成分充分。

1.2.4 PCR扩增反应：使用商品化试剂，按说明书操作，确保dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液和超纯水的量足。

1.3 扩增产物分析及结果报告

1.3.1 扩增产物分析：使用琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期范围内。其他方法如限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析及DNA序列分析。

1.3.2 结果判定和报告：实验成立需同时满足阳性对照、阴性对照和双份平行样品一致的条件。HIV核酸检测阳性需重复采样复测，复测阳性判定为阳性，阴性则为不确定结果，需进一步检测。

二、HIV核酸定量检测

2.1 方法：主要基于靶核酸扩增RT-PCR和信号放大扩增方法。国内常用方法如NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1、Amplicor Cobas等，其检测线性范围和国际单位关系各不相同。

2.2 试剂：使用注册批准的商品化试剂，严格遵循说明书操作。试剂包含RT-PCR扩增、信号放大扩增、基于核酸序列扩增（NASBA）等。

2.2.1 靶核酸扩增试剂和性能：NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1、Amplicor HIV-1 Monitor v1.5等试剂，使用不同的设备和方法，如实时荧光探针分析法、微颗粒酶免疫分析法等，检测线性范围和国际单位关系有所不同。

2.2.2 信号放大扩增试剂和性能：Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA试剂盒，利用分枝状DNA多级信号放大原理，无需RNA纯化和PCR扩增步骤。

2.2.3 实时荧光定量PCR技术：实时荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，监测PCR进程，通过标准曲线定量分析样品。

三、集合核酸定性检测

3.1 样品集合程序：根据样品量计算集合数量，依次集合并检测，同时制备阴性及阳性集合外部质控品用于RT-PCR检测。

3.2 集合样品的检测和分解路线：使用商品化试剂，严格按照说明书进行检测，集合样品数量根据试剂方案调整。

四、婴幼儿HIV感染核酸检测

4.1 适用范围：未满18个月的HIV感染产妇所生婴幼儿。

4.2 检测程序及结果报告：在婴儿出生后6周采集第一份血样本检测，若阳性尽快采集第二份血样本，若两份均阳性诊断HIV感染。若第一份阴性，满3个月再次检测。满3个月再次检测阴性，视为未感染，满12个月后开始HIV抗体检测。

五、结论

以上概述了HIV核酸检测的定性及定量方法、集合检测以及婴幼儿HIV感染的早期诊断流程，确保了HIV感染的早期发现和及时治疗。