蛋白质测定方法原理步骤

‘壹’ 常用的蛋白质含量测定方法有哪些

①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。

‘贰’ 测定蛋白质含量的方法有哪些，其原理各是什么

Bradford法测定蛋白质浓度：实验原理。

双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋。

取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致。

将液体混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

(2)蛋白质测定方法原理步骤扩展阅读：

紫外吸收法：

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

‘叁’ 如何准确测定样品中蛋白质的含量

5种方法测定蛋白质含量

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

二、双缩脲法（biuret法）

1、实验原理

双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

2、试剂与器材

（1）试剂：a、标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用0.9%nacl配制，酪蛋白用0.05n nach配制。

b、双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜和6.0克酒石酸钾钠，用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

（2）器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。

用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

（2）样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

三、folin—酚试剂法（lowry法）

1、实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。

在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

2、试剂与器材

（1）试剂

a、试剂甲： （a）10克碳酸钠，2克 naoh和0.25克酒石酸钾钠 。溶解于500毫升蒸馏水中。 （b）0.5克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。

b、试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠，25克钼酸钠及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂，50毫升蒸馏水及数滴液体溴，

开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准nach滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。

c、标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%nacl溶液。

（2）器材

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、秒表

d、试管16支

3、操作方法

（1）标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，

然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。

这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。

全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。

每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

folin—酚试剂法实验表 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6 （约250mg/ml）

蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量（mg） 吸光度值（a700）

（2）样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。

通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易folin—酚试剂法

1、试剂

（1）试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n 氯化钠、10%碳酸钠、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

（2）试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。

（3）标准蛋白质溶液：同基本法。

2、操作步骤 测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。

用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。 改良的快速简易法，可获得与 folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。

五、考马斯亮兰法（bradford法）

1、实验原理 双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

2、试剂与器材

（1）试剂：

a、标准蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

b、考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。

（2）器材：

a、可见光分光光度计

b、旋涡混合器

c、试管16支

3、操作方法

（1）标准方法

a、取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。

最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。

b、加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1ml水加5.0mg—250试剂。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)

蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量（mg） 光吸收值 （a595）

c、用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。

（2）微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml水，考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml，同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29。

‘肆’ 测定蛋白质的定量的方法有哪些及其原理各是什么

常用的蛋白质纯化方法有离子交换色谱、亲和色谱、电泳、疏水色谱等等
离子交换色谱：蛋白质和氨基酸一样会两性解离，所带电荷决定于溶液ph。ph小于pi时蛋白质带正电，ph大于pi时蛋白质带负电。不同蛋白质等电点的蛋白质在同一个溶液中，表面电荷情况不同。离子交换就是利用不同蛋白质在同一溶液中表面电荷的差异来实现分离的。
亲和色谱：生物大分子有一个特性，某些分子或基因对它们有特异性很强的吸附作用。如镍柱中ni可以与his标签的蛋白结合，这种只针对一种或一类物质的吸附就是亲和色谱的原理。
电泳：sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，sds能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的sds溶液中，
与sds分子按比例结合，形成带负电荷的sds-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的sds，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于sds与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
疏水色谱：疏水色谱基于蛋白质表面的疏水区与介质疏水配体间的相互作用，在高浓度盐作用下，蛋白质的疏水区表面上有序排列的水分子通过盐离子的破坏被释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附。疏水色谱就是利用样品中各组分在色谱填料上配基相互作用的差异，在洗脱时各组分移动速度不同而达到分离的目的。随着盐离子浓度的降低，疏水作用降低，蛋白质的水化层又形成，蛋白质被解吸附。

‘伍’ 蛋白质N端和C端的测定方法是什么基本原理是什么

n端测序的原理
蛋白质和多肽n-端测序技术是以edman化学降解法为基础的，edman化学降解，其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的n-端残基的偶联，苯氨基硫甲酰酞（ptc-肽）环化裂解，和噻唑呤酮苯氨（atz）转化为苯异硫尿氨基酸（pth-氨基酸）三个主要的化学步骤，每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基，同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个edman降解，最后通过转移的pth-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。
蛋白质c端测序3种方法：化学法、羧肽酶法、及串联质谱法
其中后两者最近普遍应用的办法。
羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶a、b和c。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时...n端测序的原理
蛋白质和多肽n-端测序技术是以edman化学降解法为基础的，edman化学降解，其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的n-端残基的偶联，苯氨基硫甲酰酞（ptc-肽）环化裂解，和噻唑呤酮苯氨（atz）转化为苯异硫尿氨基酸（pth-氨基酸）三个主要的化学步骤，每个循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基，同时暴露出新的游离的氨基酸进行下一个edman降解，最后通过转移的pth-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测定。
蛋白质c端测序3种方法：化学法、羧肽酶法、及串联质谱法
其中后两者最近普遍应用的办法。
羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶a、b和c。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是c末端氨基酸。
串联质谱法
串联质谱法原理：即在质谱中获得蛋白质肽段的碎片。肽段在质谱中的碎裂有一定规律，通常最容易断裂的是肽键位置，得到分别命名为b离子和y离子，得到这些离子的m/z的图谱，分析图谱得到的蛋白质的c端序列。

‘陆’ 测定蛋白质含量的方法有哪些,其原理各是什么.

Bradford法测定蛋白质浓度
（一）实验原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋
白质溶液测定的方法.
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法）,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的.这种蛋白
质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用.这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定
法.
考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置（max）,由465nm变为595n
m,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.
在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比.
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1g.这是因为蛋白质与染料结合后产生
的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的
多.
（2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的
大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间.
（3）干扰物质少.如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不
干扰此测定法.

‘柒’ 蛋白质检验实验步骤

选择高蛋白的食物浆液，比如豆浆和蛋清。然后准备检测蛋白质的双缩脲试剂，由A液和B液组成，A液：氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的水溶液。B液：硫酸铜的质量分数为0.01 g/mL的水溶液。

在实验时，需要现在待测液体中先在加入A液，先制造出碱性环境，满足B液与蛋白质反应的条件，这样才可以方便进行蛋白质的检测。一段时间后，如果试管中的液体变为紫色，说明待测液体中含有蛋白质，而且颜色深浅与蛋白质浓度成正比。

(7)蛋白质测定方法原理步骤扩展阅读：

蛋白质检验注意事项：

用户需要注意样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细过筛，液体样要混合均匀。

样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。

如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，800~1000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。

‘捌’ 测量蛋白质分子质量有哪些主要方法原理是什么

1.凝胶过滤法
凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子的大小、分子形状和所带电荷的多少。SDS（十二烷基磺酸钠）是一种去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的带电荷量和分子形状的差异。这样电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小，蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。
3.沉降法（超速离心法）
沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根据沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式，即可计算出蛋白质的分子质量。质的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根据沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式，即可计算出蛋白质的分子质量。

‘玖’ 国家标准检测蛋白质含量测定方法

蛋白质含量测定方法就是检测N元素的含量，像三聚氰胺的问题，就是通过增加N的含量使“蛋白质”含量提高的。

国家标准检测蛋白质含量的方法叫做凯氏定氮法，食物中的蛋白质在催化加热条件下分解，导致氨和硫酸结合产生硫酸铵。 碱蒸馏采用无硫，硼酸吸收，用硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸耗计算氮含量，再乘以转化系数，即蛋白质含量。

具体操作步骤如下：

1.样品处理

精确称量0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸收10-20ml液体样品（约30-40mg氮当量）。将其转移至干燥的100毫升或500毫升氮气固定瓶中，加入0.2克硫酸铜，6克硫酸钾和20毫升硫酸，轻轻摇动，在瓶口放置一个小漏斗，将瓶子倾斜石棉网上有45度角，有小孔。

加热小火后，内容物碳化，泡沫完全停止，加强火力，保持瓶内液体稍微沸腾，直至液体呈蓝绿色澄清透明，然后继续加热0.5小时。取出并冷却，小心加入20毫升水，冷却，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗净氮气瓶，洗净液放入容量瓶中，然后用水冲洗至刻度，混匀备用。

取相同量的硫酸铜，硫酸钾和浓硫酸作为试剂进行空白试验。然而，这种方法很危险，很难在实验室中证明。大多数实验室都有一个消化器，可以一次处理16个以上的样品和一个可以自行设定温度的呼吸机。它更安全，更可操作。

(9)蛋白质测定方法原理步骤扩展阅读

除了凯氏定氮法以外，标准的测量方法还有：

• 分光光度法

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm 下测定吸光度值，与标准系列比较定量,结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。

• 燃烧法

样品在900~1200℃下燃烧。在燃烧过程中，产生混合气体。 诸如碳，硫和盐的干扰气体被吸收管吸收，氮氧化物被还原成氮。 形成的氮气流由热导检测器（TCD）检测。

‘拾’ 蛋白质测定的原理

不同测试方法原理不一样，下面介绍一种常用的方法，凯氏定氮法的原理：
凯氏定氮法测蛋白含量：
根据凯氏定氮测得的氮含量和氮在蛋白质中的含量为1/6.25（即16%），故可计算得出蛋白质的含量。
凯氏定氮过程及化学反应如下：
浓硫酸在催化剂和高温作用下，将有机化合物消化，使其中的氮全部转换成硫酸铵，然后采用加碱（NaOH）蒸馏的方式，使硫酸铵中的铵（NH4+）以氨气的形式释放出来，再用加有指示剂的硼酸溶液吸收这些氨气，用酸滴定液滴定至终点，从而确定蛋白质中氮的含量。本方法创始人是丹麦化学家Johan Kjeldahl (1849-1900)。其反应原理如下：
催化剂
消化：含氮有机物＋H2SO4 ――――→(NH4)2SO4
420℃
蒸馏：(NH4)2 SO4 + 2NaOH→2NH3 ↑+Na2SO4 +2H2O
吸收：NH3 + H3BO3 →NH4BO2 + H2O
滴定：2NH4BO2 + H2O +H2SO4→(NH4)2SO4 +2H3BO3