湿定量计算方法视频

‘壹’ 请问：做荧光定量PCR时，△△Ct值是什么意思，它的计算公式是什么

△△Ct是荧光定量计算公式的简化形式，用于比较不同样品之间的差别或变化比率。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX₀+lgN/lg(1+Ex)，其中，n为扩增反应的循环次数，X₀为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。△Ct(n)=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）；△△CT(n)=△Ct(n)-△Ct(1)。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

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荧光定量PCR的原理：

荧光定量PCR技术：在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。

实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I法和Tag Man探针法。

Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

‘贰’ 定量分析的全过程主要包括哪些步骤

定量分析的任务是测定物质中某种或某组分的含量。定量分析过程通常包括:1、试样的采取和制备、2、称量和试样的分解、3、干扰组分的掩蔽和分离、4、定量测定和分析结果的计算和评价等
(1) 取样:根据分析对象是气体、液体、或固体，采用不同的取样方法。在取样过程中，最重要的一点是要使分析试样具有代表性。试样制备:试样经过破碎、过筛、混匀、缩分后才能得到符合分析要求的试样。破碎分为粗碎、中碎和细碎甚至研磨。每次破碎后要使样品全部通过筛孔。缩分是使粉碎后的试样量逐步减少，采用四分法。将过筛后的试样混匀，堆为锥形后压为圆饼形状，通过中心分成四等份，弃去对角的两份。是否需要继续缩分，可按下述公式进行计算。mQ(kg):试样的最小质量;k:缩分常数的经验值，试样均匀度越差，越大，通常在0.05~1 kg·mm-2之间。d(mm ):试样的最大粒度直径。· 采样与缩分试样量计算示例· 例:采集矿石样品，若试样的最大直径为10 mm， k =0.2 kg/mm2, 则应采集多少试样?· 解: mQ ≥ kd 2 = 0.2 ´ 10 2 = 20 (kg)· 例: 有一样品 mQ = 20 kg， k =0.2 kg / mm2, 用6号筛过筛, 问应缩分几次? 解: mQ ≥ kd 2 = 0.2 ´ 3.36 2 = 2.26 (kg)缩分1次剩余试样为20 ´ 0.5 = 10 (kg)，缩分3次剩余试样20´ 0.53= 2.5 (kg) ≥ 2.26，故缩分3次。从分析成本考虑，样品量尽量少，从分析误差考虑，不能少于临界值 mQ ≥ kd 2
(2)试样分解和分析试液的制备
定量化学分析一般采用湿法分析，通常要求将干燥好的试样分解后转移入溶液中，然后进行分离及测定。试样分解和分析试液的制备要求:试样分解完全; 待测物质不损失;避免引入干扰杂质。根据试样性质的不同，分解的方法亦不同。
溶解法→无机试样
熔融法 →无机试样
微波消解法→无机试样
灰化法 →有机试样
(3)分离及测定

根据待测组分的性质、含量和对分析结果准确度的要求，选择合适的分析方法。根据方法的灵敏度、选择性及适用范围等来正确选择适合的分析方法。当试样共存组分对待测组分的测定有干扰时，常用掩蔽剂消除干扰，而无合适的掩蔽方法时，必须进行分离。
(4)分析结果的计算及评价
根据分析过程中有关反应的计量关系及分析测量所得数据，计算试样中待测组分的含量。对于测定结果及误差分布情况，应用统计学方法进行评价。
二、 定量分析结果的表示
⑴ 待测组分的化学表示形式
以待测组分实际存在形式含量表示。
以氧化物或元素形式表示
以所需的组分表示
电解质溶液的分析结果，以离子含量表示
三、 待测组分的含量表示方法
固体试样:常用质量分数表示 wB=mB/ms (%)
含量很低时，μg/g(或10-6)，ng/g(10-9)，pg/g(10-12)
液体试样:
物质的量浓度:单位mol/L。
质量摩尔浓度:单位mol/kg。
质量分数:待测组分的质量除以试液的质量，量纲为1。
体积分数:待测组分的体积除以试液的体积，量纲为1。
摩尔分数:待测组分的物质的量除以试液的物质的量，量纲为1。
质量浓度:以mg/L, μg/L, μg/mL，n g/mL, p g/mL。
气体试样:常量或微量组分的含量，通常以体积分数表示。
基础化学中经常用到的定量分析仪器有:高效液相色谱仪、气相色谱仪、分光光度计、常用玻璃仪器(烧杯、量筒、玻璃棒、容量瓶等)、天平等。此外，由于行业不同，应用的分析仪器截然不同，如在生物行业中会用到PCR。

‘叁’ 标准加入法怎样的过程，如何定量计算

1、标准加入法，是将一定量已知浓度的标准溶液加入待测样品中，测定加入前后样品的浓度，加入标准溶液后的浓度将比加入前的高，其增加的量应等于加入的标准溶液中所含的待测物质的量。

2、标准加入法又称为标准增量法或直线外推法。是一种被广泛使用的检验仪器准确度的测试方法。这种方法尤其适用于检验样品中是否存在干扰物质。

3、当很难配置与样品溶液相似的标准溶液，或样品基体成分很高，而且变化不定或样品中含有固体物质而对吸收的影响难以保持一定时，采用标准加入法是非常有效的。

4、定量计算过程。假设取n份体积为V的样品，等量加入n个100毫升的容量瓶中，取不同浓度梯度的已知浓度的标准溶液，分别加入上述容量瓶中。

5、浓度梯度可按实际情况选取。例如分别选取0.100毫升、0.200毫升、0.500毫升、1.00毫升、2.00毫升等，但至少要5个梯度，另外加一个空白。加水稀释至所需刻度后，分别测定对应的吸光度A1、A2、A3、A4、A5、A6等。

6、以标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为横坐标，得到有截距的直线，把直线延长到与横坐标相交,得到的交点处的浓度值，该浓度值就是样品中待测组分的浓度。

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标准曲线法和标准加入法

1、标准曲线法适用于标准曲线的基体和样品的基体大致相同的情况，优点是速度快，缺点是当样品基体复杂时不正确。

2、标准加入法可以有效克服上面所说的缺点，因为他是把样品和标准混在一起同时测定的（“标准加入法”的叫法就是从这里来的），缺点就是速度很慢。

3、标准曲线法可在样品很多的时候使用，先做出曲线，然后从曲线上找点求浓度；标准加入法，适合样品数量少的时候用。

‘肆’ 定量分析有哪些方法

色谱定量方法：

1. 归一化法

2. 外标法

3. 内标法

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