色譜組分的檢測方法

1. 氣相色譜有幾種定量方法各有何特點及使用范圍

氣相色譜的定量方法主要有：歸一化法、外標法、內標法、內標校正曲線、內標對比法和內加法等。

（1）歸一法：優點是簡便，定量結果與進樣量無關、操作條作變化時對結果影響較小，缺點時必須所有組分在一個分析周期內都能流出色譜柱，而且檢測器對它們都產生信號。該法不能用於微量雜質的合量測定。

（2）外標法：分為校正曲線法和外標一點法。外標法不必加內標物，常用於控制分析，分析結果的准確度主要取決於進樣的准確性和操作條件的穩定程度。

（3）內標法：由於操作條件變化面引起的誤差都將同時反映在內標物及欲測組分上而得到抵清，所以該法分析結果准確度高，對進樣量准確度的要求相對較低，可測定微量組分。但實際工作中，內標物的選擇需花費大量時間，樣品的配製也比較繁瑣。

（4）內標校正曲線法：該法消除了某些操作條件的影響，也不需嚴格要求進樣體積准確。

（5）標准加入法：在難以找到合適內標物或色譜圖上難以插入內標時可採用該法。

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原理

GC主要是利用物質的沸點、極性及吸附性質的差異來實現混合物的分離，其過程如圖氣相分析流程圖所示。

待分析樣品在汽化室汽化後被惰性氣體（即載氣，也叫流動相）帶入色譜柱，柱內含有液體或固體固定相，由於樣品中各組分的沸點、極性或吸附性能不同，每種組分都傾向於在流動相和固定相之間形成分配或吸附平衡。但由於載氣是流動的，這種平衡實際上很難建立起來。

也正是由於載氣的流動，使樣品組分在運動中進行反復多次的分配或吸附/解吸附，結果是在載氣中濃度大的組分先流出色譜柱，而在固定相中分配濃度大的組分後流出。

當組分流出色譜柱後，立即進入檢測器。檢測器能夠將樣品組分轉變為電信號，而電信號的大小與被測組分的量或濃度成正比。當將這些信號放大並記錄下來時，就是氣相色譜圖了。

2. 舉一種用到特殊儀器的色譜分析法,可用來檢測哪種或哪類食品組分

1.1 固相萃取技術(SPE)
固相萃取法是一種基於液相色譜分離機制的樣品制備方法,已廣泛應用於農葯殘留檢測工作。它根據液相分離、解析、濃縮等原理,使樣品溶液混合物通過柱子後,樣品中某一組份保留在柱中,通過再選擇合適的溶劑把保留在柱中的組分洗脫下來,從而達到分離、凈化的目的。SPE克服了液-液萃取技術(LLE)及一般柱層析的缺點,具有高效、簡便、快速、安全、重復性好、便於前處理自動化等特點。根據柱中填料大體可分為吸附型(如硅膠、大孔吸附樹脂等)、分配型(C8、C18、苯基柱等)和離子交換型。據待測農葯性質、樣品種類等選用合適的微型柱和淋洗劑及其它優化條件後,可使萃取、富集、凈化一步完成[2]。
1.2 超臨界流體提取(SFE)
超臨界流體提取(SFE)是近幾年發展起來的一種特殊分離技術[3]。SFE主要是以超臨界流體代替各種溶劑來萃取樣品中待測組分的萃取方法。目前最常用的超臨界流體為CO2,它兼有氣體的滲透能力和液態的分配作用,流出液中的CO2在常壓下揮發,待測物用溶劑溶解後進行分析。超臨界CO2無毒,分子極性比較小,可用於提取非極性或弱極性農葯殘留。也可以加入適量極性調節劑,如甲醇等來調節其極性,據此可最大限度地提取不同極性的農葯殘留而最低限度地減少雜質的提取。其特點是避免了使用大量的有機溶劑、提高萃取的選擇性、減少了分析時間、實現操作自動化。SFE技術是當前發展最快的分析技術之一。
1.3 基質固相分散萃取技術(MSPDE)
基質固相分散萃取是1989年美國Louisiana州立大學的Barke教授首次提出並給予理論解釋的一種嶄新的萃取技術。其基本操作是將試樣直接與適量反相填料(C1 4或C1 8)研磨、混勻得到半干狀態的混合物並將其作為填料裝柱,然後用不同的溶劑淋洗柱子,將各種待測物洗脫下來。MSPDE濃縮了傳統的樣品前處理中所需的樣品均化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程,是簡單高效的提取凈化方法[3],適用於各種分子結構和極性農葯殘留的提取凈化,在蔬菜、水果的殘留農葯檢測中得到了廣泛應用。
1.4 分子印跡合成受體技術(MISR)
分子印跡合成受體技術(MISR)原理是:首先使擬被印跡的分子或聚合物單體鍵合,然後將聚合物單體交聯體再將印跡分子從聚合物中提取出來,聚合物內部就留下了被印跡分子的印跡。由於需要合成被印跡分子衍生物,使該項技術受到限制,因為有些化合物的分子無法進行衍生化。分子印跡技術可以用於葯物、激素、蛋白質、農葯、氨基酸、多肽、碳水化合物、輔酶、核酸鹼基、甾醇、塗料、金屬離子等各種化合物的分離工作。
2 檢測方法
2.1 氣相色譜法(GC)
氣相色譜法是一種經典的分析方法。利用試樣中各組份在氣相和固定液液相間的分配系數不同,當汽化後的試樣被載氣帶入色譜柱中運行時,組份就在其中的兩相間進行反復多次分配,經過一定的柱長後,便彼此分離,按順序離開色譜柱進入檢測器,產生的離子流訊號經放大後,在記錄器上描繪出各組份的色譜峰。由於其具有操作簡便、分析速度快、分離效能高、靈敏度高以及應用范圍廣等特點,目前農葯殘留物檢測70%採用氣相色譜法來進行。使用氣相色譜法,多種農葯可一次進樣,得到完全的分離、定性和定量,再配置高性能的檢測器,使分析速度更快,結果更可靠。目前氣相色譜法多採用填充毛細管。
2.2 高效液相色譜法(HPLC)
高效液相色譜法也是一種傳統的檢測方法。它可以分離檢測極性強、分子量大的離子型農葯,尤其適用於對不易氣化或受熱易分解農葯的檢測。近年來,採用高效色譜柱、高壓泵和高靈敏度的檢測器、柱前或柱後衍生化技術以及計算機聯用等,大大提高了液相色譜的檢測效率、靈敏度、速度和操作自動化程度,現已成為農葯殘留檢測不可缺少的重要方法。
2.3 超臨界流體色譜(SFC)技術
超臨界流體色譜(SFC)是以超臨界流體作為色譜流動相的分離檢測技術[1]。可以使用各種類型的較長色譜柱,可以在較低溫度下分析分子量較大、對熱不穩定的化合物和極性較強的化合物,它綜合利用了氣象色譜和高效液相色譜的優點,克服了各自的缺點,可以與大部分GC和HPLC的檢測器相連接,如FID、FPD、NPD以及MS等連用[4]。這樣就極大地拓寬了其應用范圍,許多在GC或HPLC上需經過衍生化才能分析的農葯,都可以用SFC直接測定。
2.4 直接光譜分析技術
近紅外衰減全反射光譜(NearIS-ATR)和表面增強拉曼光譜(SERS)使光譜分析的靈敏度提高102~107倍。這些快速直接的光譜技術,只需要極少量的樣品,具有很大的應用潛力。一系列激光光譜技術,如激光拉曼光譜等使光譜分析的靈敏度幾乎達到極限-一個分子或原子的水平。這將為開發高靈敏度的檢測器提供可能的技術基礎。目前,這些靈敏度極高的光譜技術還需要進一步研究開發才能進入廣泛應用階段。
2.5 毛細管電泳(CE)
毛細管電泳技術是在電泳技術的基礎上發展的一種分離技術。其工作原理是使毛細管內的不同帶電粒子(離子、分子或衍生物)在高壓場作用下以不同的速度在背景緩沖液中定向遷移,從而進行分離。根據樣品組分的背景緩沖液中所受作用的不同,CE又被分為毛細管區帶電泳(CZE)、毛細管凝膠電泳(CGE)、等電聚焦(IEF)、膠束電動色譜(MEKC)、等速電泳(ITP)等幾大類。自80年代Jorgenson把E應用於分析化學以來,這一技術已發展成為分離科學中最活躍的領域之一。它具有靈敏度高、耗資少、樣品消耗量很小(每次進樣只是納升級)、分離柱效高、使用方便等優點,非常適用於那些難以用傳統的液相色譜法分離的離子化樣品的分離與分析,其分離效率可達數百萬理論塔板數。目前,毛細管電泳尚缺乏靈敏度很高的檢測器。因此,只有研究開發靈敏度更高的檢測系統,該技術的優勢才能充分發揮出來。
2.6 液相色譜-質譜聯用技術(LC/MS)
液—質聯用技術(LC-MS)是將液相色譜與質譜串聯成為一個整機使用的檢測技術。用來分析低濃度、難揮發、熱不穩定和強極性農葯。LC/MS先後產生四種介面技術:熱噴霧(TSP)、粒子束(PB)、電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學電離(APCI)。現在,一種內噴射式和粒子流式介面技術將液相色譜與質譜聯接起來,已成功地用於分析對熱不穩定,分子量較大,難以用氣相色譜分析的化合物。具有檢測靈敏度高、選擇性好、定性定量同時進行、結果可靠等優點。LC-MS對簡單樣品可進行分析前凈化並具有幾乎通用的多殘留分析能力,用於對初級監測呈陽性反應的樣品進行在線確證,其優勢明顯。盡管LC/MS儀器價格昂貴,液相色譜和質譜的介面技術尚不十分成熟,但它仍是一種很有利用價值的高效率、高可靠性分析技術。
2.7 免疫分析法(IA)
免疫分析法是基於抗原抗體的特異性識別和結合反應為基礎的分析方法[5]。分子量大的農葯可以直接作為抗原進入脊椎動物的體內產生免疫應答,從而得到可以和該農葯分子特異性結合的抗體;分子量小的農葯(分子量<2500)一般不具備免疫抗性,不能刺激動物產生免疫反應。將農葯小分子以半抗原的形式通過一定碳鏈長度的分子量大的載體蛋白質(通常使用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、卵清蛋白)用共價鍵偶聯製成人工抗原,使動物產生免疫反應,產生識別該農葯並與之特異性相結合的抗體。通過對半抗原或抗體進行標記,利用標記物的生物、物理、化學放大作用,對樣品中特定的農葯殘留物進行定性、定量檢測。免疫分析法被列為90年代優先研究、開發和利用的農葯殘留分析技術,美國化學會將免疫分析與氣象色譜、液相色譜共同列為農葯殘留分析的支柱技術[6]。免疫分析法具有快速、簡單、靈敏和選擇性高等優點,目前已廣泛應用於糧食、水果、蔬菜、肉、奶、水和土壤中農葯殘留的檢測。根據採用的檢測手段不同,可分為放射免疫法、熒光免疫法、酶免疫法、流動注射免疫分析法等,其中以酶免疫法應用最為廣泛[7]。

3. 色譜法分幾種

2. 液相色譜法 (liquid chromatography 簡稱 LC)用液體作流動相的色譜法。 3. 超臨界流體色譜法 (SFC) 用超臨界狀態的流體作流動相的色譜法。 超臨界狀態的流體不是一般的氣體或流體 , 而是臨界壓力和臨界溫度以上高度壓縮的氣體 , 其密度比一般氣體大得多而與液體相似 , 故又稱為 「 高密度氣相色譜法 」 （二）按分離原理分 1. 吸附色譜法（ adsorption chromatography ）： 根據吸附劑表面對不同組分物理吸附能力的強弱差異進行分離的方法。 如：氣一固色譜法、液-固色譜法——吸附色譜 2. 分配色譜法 （partition chromatography ）： 根據不同組分在固定相中的溶解能力和在兩相間分配系數的差異進行分離的方法。 如：氣-液色譜法、液-液色譜法——分配色譜 3. 離子交換色譜法（ion exchange chromatography ） 根據不同組分離子對固定相親和力的差異進行分離的方法。 4. 排阻色譜法（ size exclusion chromatography）： 又稱凝膠色譜法 （gel chromatography ）, 根據不同組分的分子體積大小的差異進行分離的方法。 其中：以水溶液作流動相的稱為凝膠過濾色譜法 ；以有機溶劑作流動相的稱為凝膠滲透色譜法。 5. 親合色譜法 (affinity chromatography) 利用不同組分與固定相共價鍵合的高專屬反應進行分離的方法。 （三）按固定相的形式 1. 柱色譜法（column chromatography ）： 固定相裝在柱中 , 試樣沿著一個方向移動而進行分離。 包括 填充柱色譜法：固定相填充滿玻璃管和金屬管中 開管柱色譜法：固定相固定在細管內壁（毛細管柱色譜法） 2. 平板色譜法 （planer chromatography ）： 固定相呈平面狀的色譜法。 包括 紙色譜法： 以吸附水分的濾紙作固定相； 薄層色譜法：以塗敷在玻璃板上的吸附劑作固定相。|||色譜法（又稱層析法）根據其分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等。吸附色譜法是利用被分離物質在吸附劑上被吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚醯胺等有吸附活性的物質。分配色譜是利用被分離物質在兩相中分配系數的不同使組分分離；其中一相被塗布或鍵合在固體載體上，稱為固定相,另一相為液體或氣體,稱為流動相。常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜是利用被分離物質在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離；常用的有不同強度的陽、陰離子交換樹脂，流動相為水或含有機溶劑的緩沖液。分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，是利用被分離物質分子量大小的不同導致在填料上滲透程度不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，根據固定相和供試品的性質選用水或有機溶劑作為流動相。 色譜法又可根據分離方法分為：紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。所用溶劑應與供試品不起化學反應,純度要求較高。分析時的溫度,除氣相色譜法或另有規定外，系指在室溫操作。分離後各成分的檢出，應採用各品種項下所規定的方法。採用紙色譜法、薄層色譜法或柱色譜法分離有色物質時，可根據其色帶進行區分，分離無色物質時，可在短波(254nm)或長波(365nm)紫外光燈下檢視，其中紙色譜或薄層色譜也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質的薄層硅膠，採用熒光猝滅法檢視；柱色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法可用接於色譜柱出口處的各種檢測器檢測；柱色譜法還可分部收集流出液後用適宜方法測定。|||氣相色譜法系採用氣體為流動相（載氣）流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化後，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先後進入檢測器，用記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。 高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內，在柱內各成分被分離後，依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。 氣相色譜和液相色譜各有其優缺點和應用范圍： 氣相色譜採用氣體作為流動相，由於物質在氣相中的流速比在液相中快得多，氣體又比液體的滲透性強，因而相比液相色譜，氣相色譜柱阻力小，可以採用長柱，例如毛細管柱，所以分離效率高。 由於氣相色譜毋需使用有機溶劑和價格昂貴的高壓泵，因此氣相色譜儀的價格和運行費用較低，且不易出故障。 能和氣相色譜分離相匹配的檢測器種類很多，因而可用於各種物質的分離與檢測。特別是當使用質譜儀作為檢測器時，氣相色譜很容易把分離分析與定性鑒定結合起來，成為未知物質剖析的有力工具。 氣相色譜不能分析在柱工作溫度下不汽化的組分，例如，各種離子狀態的化合物和許多高分子化合物 氣相色譜也不能分析在高溫下不穩定的化合物，例如蛋白質等。 液相色譜則不能分析在色譜條件下為氣體的物質，但卻能分離不揮發、在某溶劑中具有一定溶解度的化合物，例如高分子化合物、各種離子型化合物以及受熱不穩定的化合物（蛋白質、核酸及其它生化物質）。|||色譜法分類 （一）按兩相物理狀態分 1. 氣相色譜法 (gas chromatography 簡稱 GC)用氣體作流動相的色譜法。 2. 液相色譜法 (liquid chromatography 簡稱 LC)用液體作流動相的色譜法。 3. 超臨界流體色譜法 (SFC) 用超臨界狀態的流體作流動相的色譜法。 超臨界狀態的流體不是一般的氣體或流體 , 而是臨界壓力和臨界溫度以上高度壓縮的氣體 , 其密度比一般氣體大得多而與液體相似 , 故又稱為 「 高密度氣相色譜法 」（二）按分離原理分 1. 吸附色譜法（ adsorption chromatography ）： 根據吸附劑表面對不同組分物理吸附能力的強弱差異進行分離的方法。 如：氣一固色譜法、液-固色譜法——吸附色譜 2. 分配色譜法 （partition chromatography ）： 根據不同組分在固定相中的溶解能力和在兩相間分配系數的差異進行分離的方法。 如：氣-液色譜法、液-液色譜法——分配色譜 3. 離子交換色譜法（ion exchange chromatography ） 根據不同組分離子對固定相親和力的差異進行分離的方法。 4. 排阻色譜法（ size exclusion chromatography）： 又稱凝膠色譜法 （gel chromatography ）, 根據不同組分的分子體積大小的差異進行分離的方法。 其中：以水溶液作流動相的稱為凝膠過濾色譜法 ；以有機溶劑作流動相的稱為凝膠滲透色譜法。 5. 親合色譜法 (affinity chromatography) 利用不同組分與固定相共價鍵合的高專屬反應進行分離的方法。 （三）按固定相的形式 1. 柱色譜法（column chromatography ）： 固定相裝在柱中 , 試樣沿著一個方向移動而進行分離。 包括 填充柱色譜法：固定相填充滿玻璃管和金屬管中 開管柱色譜法：固定相固定在細管內壁（毛細管柱色譜法） 2. 平板色譜法 （planer chromatography ）： 固定相呈平面狀的色譜法。 包括 紙色譜法： 以吸附水分的濾紙作固定相； 薄層色譜法：以塗敷在玻璃板上的吸附劑作固定相。|||還有一種現在常用的色譜即：高速逆流色譜，它屬於液－液分配色譜。利用樣品中各組分在兩相溶劑間分配比的差異，進行分離。它是不用固態載體的全液態的液-液分配色譜技術.優點：高效提純，能將樣品中有效成分提純至98％以上理論回收率為100％ ，不存在樣品的不可逆吸附，極大地避免了樣品的變性問題操作簡單，無需太多樣品前處理等。相對於HPLC,溶質的分離原理僅於分配有關，避免了HPLC柱子與柱子之間的重現性差的現象。現在廣泛用於天然產物的制備分離。相關書籍參考《高速逆流色譜分離技術及應用》曹學麗 編著 化學工業出版社|||一）按兩相所處的狀態分類 液體作為流動相，稱為「液相色譜」（liquid chromatograp-hy）；用氣體作為流動相，稱為「氣相色譜」（gas chromatogr-aphy）。固定相也有兩種狀態，以固體吸附劑作為固定相和以附載在固體上的液體作為固定相，所以層析法按兩相所處的狀態可以分為： 液－固色譜（liquid-solid chromatography）液－液色譜（liquid-liquid chromatography） 氣－固色譜（gas-solid chromatography） 氣－液色譜（gas-liquid chromatography）（二）按層析過程的機理分類 吸附層析（adsorption chromatography ）利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析（partition chromatography）利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數（或溶解度）不同，而使之分離的方法。 離子交換層析（ion-exchange chromatography ）利用不同組分對離子交換劑親和力的不同，而進行分離的方法。凝膠層析（gelchromatography）利用某些凝膠對於不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異，進行分離的技術。 （三）按操作形式不同分類 柱層析（colum chromatography）將固定相裝於柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析（paper chrmatography）用濾紙作液體的載體（擔體support），點樣後，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析（thin layper chromatography）將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。 >|||色譜法根據其分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等 色譜法又可根據分離方法分為：紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。

4. 為什麼氣相色譜測定某組分含量用內標法

內標法(Internal Standard Method)是色譜分析中一種比較准確的定量方法，尤其在沒有標准物對照時，此方法更顯其優越性。內標法是將一定重量的純物質作為內標物（參見內標物條）加到一定量的被分析樣品混合物中，然後對含有內標物的樣品進行色譜分析，分別測定內標物和待測組分的峰面積（或峰高）及相對校正因子，按公式即可求出被測組分在樣品中的百分含量。

5. 在色譜分析中，還有哪些定量分析方法

氣相色譜分析嚴格來講是一種定量分析方法，如果不配置質譜儀等專用定性的儀器聯勝，其本身並不能真正定性，因為氣相色譜、液相色譜等色譜法本身的原理只是通過色譜柱將待測物質組份進行分離後再通過檢測器進行檢測，而且常用的fid,tcd,ecd,fpd等檢測器本身並不能定性，只能進行相對定量檢測計算；
之所以說氣相色譜可以定性，那是是一種對照判斷式定性，就是將通過在相同的色譜分析條件下在相同時間段內出現的峰認定為同一種物質。這種認定一般對已經物質的定性是准確的，但對未知物質和同分異構體是無法分別的；
氣相色譜儀分析根據定量對照計算方法的不同分為：歸一法，校正歸一法，內標法，外標法等常用方法。
歸一法：就是將所有峰數據的總數歸一，根據各組份的峰面積在總面積中所佔比例計算各組份的百分比，由於事實上檢測器對不同的物質的響應因子並不相同，導致峰面積比在事實上並不能代表真實組份含量比，因此這是一種粗略的相對測控法，並不準確。常被用於工廠對已知組份生產過程的控制粗測，此時並不需要准確知道具體含量值，只需要知道比例范圍是否發生變化。

6. 有哪些常用的色譜定量方法

色譜定量方法比較2006年12月20日
星期三
15:31定量分析常用術語：
樣品（sample）含有帶測物，供色譜分析的溶液。分為標樣和未知樣。
標樣（standard）濃度已知的純品。
未知樣（unknow）濃度待測的混合物。
樣品量（sample
weight）待測樣品的原始稱樣量。
稀釋度（dilution）未知樣的稀釋倍數。
組分（componance）欲做定量分析的色譜峰，即含量未知的被測物。
組分的量（amount）被測物質的含量（或濃度）。
積分（integerity）由計算機對色譜峰進行的峰面積測量的計算過程。
校正曲線（calibration
curve）組分含量對響應值的線性曲線，由已知量的標准物建立，用於測定待測物的未知含量。
常用的定量方法
標准曲線法，分為外標法和內標法。
外標法在液相色譜中用的最多。
內標法准確但是麻煩，在標准方法中用的最多。
外標法
用被測化合物的純品作為標准樣品，配製成一系列的已知濃度的標樣。
注入色譜柱的到其響應值（峰面積）。
在一定范圍內，標樣的濃度與響應值之間存在較好的線性關系，即W=f×A，製成標准曲線。
在完全相同的實驗條件下，注入未知樣品，得到欲測組分的響應值。
根據已知的系數f，即可求出欲測組分的濃度
外標法的優點：
操作、計算簡單，是一種常用的定量方法。
無需各組分都被檢出、洗脫。
需要標樣。
標樣及未知樣品的測定條件要一致。
進樣體積要准確。
外標法缺點：
實驗條件要求高，如檢測器的靈敏度，流速、流動相組成的不能發生變化；每次進樣體積要有好的重復性。
內標法
操作：
將已知量的內標樣加入標准樣品，製成混合標樣，並配製一系列的已知濃度的工作標樣。混合標樣中標樣與內標樣的摩爾比不變。
注入色譜柱，以（標樣峰面積/內標樣峰面積）為響應值。
根據響應值與工作標樣濃度之間存在的線性關系，即W=f×A，製成標准曲線。
將已知量的內標樣加入未知樣品，注入色譜柱，得到欲測組分的響應值。
根據已知的系數f，即可求出欲測組分的濃度
內標法的特點：
操作過程中樣品和內標是混合在一起注入色譜柱的，因此只要混合溶液中被測組分與內標的量的比值恆定，上樣體積的變化不會影響影響定量結果。
內標法抵消了上樣體積，乃至流動相、檢測器的影響，因此比外標法精確。

7. 氣相色譜法的分析方法

氣相色譜法的分析方法分為以下幾個步驟：

1、樣品的來源和預處理方法

GC能直接分析的樣品必須是氣體或液體，固體樣品在分析前應當溶解在適當的溶劑中，而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無機鹽），可能會損壞色譜柱的組分。這樣，我們在接到一個未知樣品時，就必須了解的來源，從而估計樣品可能含有的組分，以及樣品的沸點范圍。如能確認樣品可直接分析。如果樣品中有不能用GC直接分析的組分，或樣品濃度太低，就必須進行必要的預處理，包括採用一些預分離手段，如各種萃取技術、濃縮和稀釋方法、提純方法等。

2、確定儀器配置

所謂儀器配置就是用於分析樣品的方法採用什麼進樣裝置、什麼載氣、什麼色譜柱以及什麼檢測器。

3、確定初始操作條件

當樣品准備好，且儀器配置確定之後，就可開始進行嘗試性分離。這時要確定初始分離條件，主要包括進樣量、進樣口溫度、檢測器溫度、色譜柱溫度和載氣流速。進樣量要根據樣品濃度、色譜柱容量和檢測器靈敏度來確定。樣品濃度不超過mg/mL時填充柱的進樣量通常為1-5uL，而對於毛細管柱，若分流比為50：1時，進樣量一般不超過2uL。進樣口溫度主要由樣品的沸點范圍決定,還要考慮色譜柱的使用溫度。原則上講，進樣口溫度高一些有利，一般要接近樣品中沸點的組分的沸點，但要低於易分解溫度。

4、分離條件優化

分離條件優化目的就是要在*短的分析時間內達到符合要求的分離結果。在改變柱溫和載氣流速也達不到基線分離的目的時，就應更換更長的色譜柱，甚至更換不同固定相的色譜柱，因為在GC中，色譜柱是分離成敗的關鍵。

5、定性鑒定

所謂定性鑒定就是確定色譜峰的歸屬。對於簡單的樣品，可通過標准物質對照來定性。就是在相同的色譜條件下，分別注射標准樣品和實際樣品，根據保留值即可確定色譜圖上哪個峰是要分析的組分。定性時必須注意，在同一色譜柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以，對未知樣品的定性僅僅用一個保留數據是不夠的，雙柱或多柱保留指數定性是GC中較為可靠的方法，因為不同的化合物在不同的色譜柱上具有相同保留值的幾率要小得多。

6、定量分析

要確定用什麼定量方法來測定待測組分的含量。常用的色譜定量方法不外乎峰面積（峰高）百分比法、歸一化法、內標法、外標法和標准加入法（又叫疊加法）。峰面積（峰高）百分比法*簡單，但*不準確。只有樣品由同系物組成、或者只是為了粗略地定量時該法才是可選擇的。相比而言，內標法的定量精度，因為它是用相對於標准物（叫內標物）的響應值來定量的，而內標物要分別加到標准樣品和未知樣品中，這樣就可抵消由於操作條件（包括進樣量）的波動帶來的誤差。至於標准加入法，是在未知樣品中定量加入待測物的標准品，然後根據峰面積（或峰高）的增加量來進行定量計算。其樣品制備過程與內標法類似但計算原理則完全是來自外標法。標准加入法定量精度應該介於內標法和外標法之間。

7、方法的驗證

所謂的方法驗證，就是要證明所開發方法的實用性和可靠性。實用性一般指所用儀器配置是否全部可作為商品購得，樣品處理方法是否簡單易操作，分析時間是否合理，分析成本是否可被同行接受等。可靠性則包括定量的線性范圍、檢測限、方法回收率、重復性、重現性和准確度等。